[发明专利]转基因获得抗真菌病害切花非洲菊的方法

摘要

本发明涉及一种转基因获得抗真菌病害切花非洲菊的方法。它经过抗真菌基因几丁质酶基因Chi和β－1，3－葡聚糖酶基因Glu的分离、克隆和双价表达载体的构建，以及非洲菊高效遗传转化再生体系的建立、抗真菌基因对非洲菊的转化等步骤，获得转基因植株。本发明以CaMV35S为启动子，将Chi、Glu、Npt II在内的基因转化到切花非洲菊品种‘红帽子’中，获得了转基因植株，从而为获得大量的抗真菌病害的转基因非洲菊株系提供技术支持。该方法在有效提供抗真菌病害非洲菊转基因株系的同时，还将为非洲菊基因工程育种提供一条快速、有效、稳定的技术路径。

主权项

1、一种转基因获得抗真菌病害切花非洲菊的方法，其特征在于包括下列步骤：步骤1，以菜豆、烟草为试材进行Chi基因及Glu基因的分离、克隆及表达载体的构建：(1)基因分离与克隆A、Chi基因扩增引物：根据菜豆几丁质酶cDNA序列GenBank M13968设计引物如下：P1：5’GAATGAGGCTTTGTAAATTCAC 3’P2：5’CGTTAATTTCCAAAAGACCTCTGGT 3’B、Glu基因扩增引物：根据烟草葡聚糖酶cDNA序列GenBank X53600设计引物如下：P3：5’AAATGGCTGCTATCACACTCCTAG 3’P4：5’CGTCACCCAAAGTTGATATTATATTTGG 3’C、总RNA的提取及PCR产物扩增：分别从菜豆及烟草中提取总RNA，经逆转录酶将RNA逆转录cDNA，并利用逆转录的cDNA在下列反应体系中进行PCR扩增，得所需的Pcr产物：10×Pcr buffer 2.5uldNTP(2.0mM) 2ulMgCl2 2ulPrimerl(10pmol/ul) 1ulPrimer2(10pmol/ul) 1ulTaq酶(1ug/ul) 0.5ulcDNA(25ng) 2ulH2O 11ulD、对Pcr产物补平：利用Klenow片段对上述Pcr产物进行补平反应，其反应体系为：Klenow片段Buffer 10ulKlenow片段 3ul2.5mM的dNTP 17ulPcr产物 70ul反应条件为：37℃，1h，得到末端补平DNA产物；E、末端补平DNA产物的去磷酸化：对上述末端补平DNA产物进行去5’端去磷酸化反应后，回收补平DNA产物及T-载体克隆后，获得克隆Chi/T-Vector及Glu/T-Vector；(2)表达载体的构建A、pB-Chi、pB-Glu表达载体的构建：分别用Sal I酶切Chi/T-Vector和Glu/T-Vector，用Klenow片段按步骤1-(1)-D的体系对其补平，再用SacI酶切，1％的电泳检测，回收958bp和940bp的目的片段；同时用SmaI的酶切质粒pBI121，再用SacI酶切，回收载体大片段；T4DNA连接酶分别作载体与目的片段的连接，连接产物分别转化E.coli DH5a，EcoR I/HindIII双酶切鉴定pB-Chi质粒的阳性克隆，Xab I/XhoI双酶切鉴定pB-Glu质粒的阳性克隆，获得连接方向正确的pB-Chi、pB-Glu表达载体；B、pB-Chi-Glu双价表达载体的构建：用EcoRI酶切pB-Chi，用Klenow片段按步骤1-(1)-D的体系对其补平，再用HinIII酶切后，用Klenow片段按步骤1-(1)-D的体系补平，电泳回收2.0kb片段，此片段包括CaMV35S-Chi-Nos，然后按步骤1-(1)-E的过程去磷酸化；用HindIII酶切pB-Glu，用Klenow片段按步骤1-(1)-D的体系对其补平，无水酒精沉淀载体，溶解，按步骤1-(1)-E的过程去磷酸化，T4DNA连接酶作载体与目的片段连接，连接产物转化coli DH5a，以Pst I酶切鉴定pB-Chi-Glu的阳性克隆，获得经检测的连接方向与预期目的一致的pB-Chi-Glu双价表达载体质粒；步骤2，非洲菊高效转化再生体系的建立(1)培养非洲菊愈伤组织选择离体培养条件下生长健康的非洲菊单株，以叶柄带有小愈伤组织的叶片为材料，在非洲菊愈伤组织诱导培养基：即Ms+6.0-10.0mg/L的6-BA+0.5-1.5mg/L的NAA上进行培养，其培养温度为24±1℃，光照为20001x；14-21天后在叶柄基部长出带有绿色生长点的愈伤组织，无菌条件下切下长出的愈伤组织(2)抗真菌基因对非洲菊的转化A、农杆菌感受态细胞的制备：挑取农杆菌LBA4404，接种于5ml含有50-80mg/L的卡那霉素Km和5-10mg/L的利福平Rif的LB液体培养基中，LB培育基配方如下：8g/L的细菌培养用胰蛋白胨+5g/L的细菌培养用酵母提取粉+10g/L的NaCl，于28℃、200rpm培养过夜；取2ml培养物于相同LB液体培养基中继续培养，至OD600为0.4-0.6，将培养物冰浴30min，4℃、5000rpm离心5min，弃上清，用1ml的浓度为20mmol/L的冷CaCl2悬浮，分装成50μl/管，加15％的甘油，液氮中冷冻后-70℃保存，得感受态细胞；B、质粒向农杆菌中的转化：把上述制备好的感受态细胞在冰上融化，加入1ug质粒pB-Chi-Glu，冰上放置30min后，液氮速冻5min，37℃水浴3～5min至完全融化，冰上放置2min，加600ul上述A步骤的LB液体，28℃温度下200rpm恢复培养3～5h，5000rpm离心3～5min，收集菌体，留50～100ul重悬，涂在含有抗生素的下列LB平板：8g/L的细菌培养用胰蛋白胨+5g/L的细菌培养用酵母提取粉+10g/L的NaCl+15g琼脂+50-100mg/L的Km+5-8mg/L的Rif，28℃培养2天，得根癌农杆菌pB-Chi-Glu/LBA4404单菌落板；C、农杆菌对非洲菊愈伤组织的侵染：挑取上述根癌农杆菌pB-Chi-Glu/LBA4404单菌落，在含量为50～80mg/L Rif的下列LB培养基：即8g/L的细菌培养用胰蛋白胨+5g/L的细菌培养用酵母提取粉+10g/L的NaCl+50～80mg/L的Km+5～10mg/L的Rif中，震荡培养过夜，得活化菌液，用该活化菌液对步骤2-(1)的非洲菊愈伤组织进行侵染，侵染8-10min，转入Ms培养基中，黑暗下培养2天，到经侵染的愈伤组织材料；D、转化植株的抗生素筛选：将上述侵染植株转到选择培养基：即Ms+0.4～0.2mg/L的6-BA+0.5～1.5mg/L的NAA+0.2～0.4mg/L的KT+25mg/L的Km+50-80mg/L的Rif中，于28℃培养14天，分化出的正常非洲菊转化苗，转入分化培养基：即Ms+0.4～0.2mg/L的6-BA+0.5～1.5mg/L的NAA++0.2～0.4mg/L的KT中，于28℃培养20天，筛选出的生长正常的非洲菊株系在步骤三的继代培养基上进行扩繁，得抗生素筛选的转基因阳性植株。