[发明专利]转基因获得抗真菌病害切花非洲菊的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重要花卉植物的抗病性育种技术方法，尤其是整合了来源不同的两种基因对非洲菊进行遗传转化，从根本上解决了非洲菊主栽地区真菌病害危害严重的难题。本技术属于生物技术育种领域。

背景技术

非洲菊(Gerbera jamesonii Bolus)，又名扶郎花，为菊科菊木族大丁草属多年生宿根草本花卉，世界著名五大鲜切花之一，起源于南非德兰士瓦地区。非洲菊约有42个种，主要分布于南非、马达加斯加、印度、中国、蒙古、日本、南美和澳大利亚，因其花色丰富、形态优美，深受世界人民喜爱。如今，非洲菊已成为重要的贸易商品，并与月季、菊花、康乃馨和郁金香成为世界著名的观赏植物种类。全世界30国家和地区广泛栽培，国内十多个省市均有栽培，面积约为800公顷，云南栽培面积为296公顷。

随着非洲菊种植面积的扩大，真菌病害在其主要种植区均有普遍发生，且危害日趋严重，昆明地区一般发病率为10％-30％，重者达70％-80％。其中较为明显的有白粉病、斑点病、疫病、根腐病等，真菌病害发生严重影响了非洲菊鲜切花的产量及品质。由于污染环境、成本高、成效有限等因素，物理或化学土壤灭菌和使用内吸杀菌剂均不能满足花卉生产的要求。转基因育种技术的发展为其提供了新的解决途径。真菌细胞壁主要由几丁质和β-1，3-葡聚糖组成，几丁质存在于真菌细胞壁的内部，葡聚糖则在细胞内、外部均有，内部与几丁质形成复合物。通过对几丁质酶基因(Chitinase gene)和β-1，3-葡聚糖酶基因(β-1，3-glucanase gene)在植物中的转化能有效抵抗真菌病害造成的危害。几丁质酶及β-1，3-葡聚糖酶均分为三类，其中I类对真菌具有较强的抑制活性。大量实验证明，几丁质酶与β-1，3-葡聚糖酶具有协同抗真菌作用。此外，获得的转基因植株不仅能有效抵抗真菌病害，对线虫也有一定的抗性。因此，利用基因工程手段创造非洲菊抗真菌病害新品种对解决其真菌病害引起的生产问题有着主要的实际应用意义。

发明内容

本发明的目的在于利用生物技术方法创造能有效抵抗真菌病害侵染的非洲菊新品种，以期获得自身高抗真菌病害，同时又不影响观赏价值的新型转基因非洲菊新品种。

本发明通过下列技术方案完成：一种转基因获得抗真菌病害切花非洲菊的方法，其特征在于包括下列步骤：

步骤1，以菜豆、烟草为试材进行Chi基因及Glu基因的分离、克隆及表达载体的构建：

(1)基因分离与克隆

A、Chi基因扩增引物：根据菜豆几丁质酶cDNA序列GenBank M13968设计引物如下：

P₁：5’GAATGAGGCTTTGTAAATTCAC  3’

P₂：5’CGTTAATTTCCAAAAGACCTCTGGT  3’

B、Glu基因扩增引物：根据烟草葡聚糖酶cDNA序列GenBank X53600设计引物如下：

P₃：5’AAATGGCTGCTATCACACTCCTAG  3’

P₄：5’CGTCACCCAAAGTTGATATTATATTTGG  3’

C、总RNA的提取及PCR产物扩增：分别从菜豆及烟草中提取总RNA，经逆转录酶将RNA逆转录cDNA，并利用逆转录的cDNA在下列反应体系中进行PCR扩增，得所需的Pcr产物：

10×Pcr buffer    2.5ul

dNTP(2.0mM)       2ul

Mgcl₂              2ul

Primer1(10pmol/ul) 1ul

Primer2(10pmol/ul) 1ul

Taq酶(1ug/ul)      0.5ul

cDNA(25ng)         2ul

H₂O                11ul

D、对Pcr产物补平：利用Klenow片段对上述Pcr产物进行补平反应，其反应体系为：

Klenow片段Buffer 10ul

Klenow片段       3ul

2.5mM的dNTP      17ul

Pcr产物          70ul

反应条件为：37℃，1h，得到末端补平DNA产物；