[发明专利]测定母乳中合成麝香浓度的方法

摘要

本发明涉及一种可稳定检测母乳中合成麝香浓度的方法，通过凝胶色谱柱化学预处理方法以及气相色谱与质谱联用技术相结合的方法来达到测定母乳中合成麝香浓度的目的。本发明属有机化学物质的物理化学分析测定技术领域。本发明方法中，母乳预处理过程包括液液萃取、过凝胶色谱柱，淋洗液浓缩后的溶液过硅胶小柱处理，最后进入色谱仪－质谱仪(GC－MS)进行检测，得到母乳试样中含有各种合成麝香的质谱曲线图，然后利用特定公式进行计算母乳中含有的麝香浓度。本发明方法是一种稳定的、较高精确度的有效测定方法。

主权项

1.一种测定母乳中合成麝香浓度的方法，其特征在于具有以下的过程和步骤：A、液液萃取和恒重脂肪：量取5ml母乳样品放入分液漏斗中，加入0.01μg回收率指示物D10-菲，随后加入8ml 8％的草酸钾和10ml乙醇充分摇匀，再加入5ml的乙醚振荡，将所述混合液进行液液萃取；先加入20ml正己烷，充分振荡，静置分层，待液面分层后，进行分液，取上层清液倒入鸡心瓶中，待用；将收集到的下层浑浊液再倒入分液漏斗中，加入10ml正己烷，充分振荡，静置分层，取上层清液倒入原待用的鸡心瓶中；下层浑浊液按上述同样方法逐级重复萃取三次，之后弃去下层浑浊液；将并和收集于原鸡心瓶中的澄清液置于旋转蒸发仪上进行旋蒸，旋蒸至体积2～3ml；然后转移至事先称重的棕色小瓶中，用氮气柔和氮吹至干，放于干燥器中恒重2天，将恒重的脂肪称量，记录下脂肪重量；B、上凝胶色谱柱(GPC柱)处理：将上述恒重的脂肪用少量正己烷和二氯甲烷的混合液溶解，两者的体积比即正己烷∶二氯甲烷＝1∶1；然后过凝胶色谱柱(GPC柱)；该柱填料为Bio-Beads S-X3凝胶，其作用是使母乳通过GPC柱而分离其中的脂肪，淋洗液为165ml的正己烷和二氯甲烷(v/v＝1∶1)的混合液，用量筒接取前65ml的淋洗液，弃去，然后用100ml的量筒接取剩余的100ml淋洗液，将该淋洗液转移至鸡心瓶中，置于旋转蒸发仪上进行旋蒸，旋蒸至2ml，待用；C、过硅胶小柱处理：将上述待用的2ml溶液过硅胶小柱处理，该柱中主要装有一定高度的硅胶，其作用主要是去除溶液中的杂质；先加入15ml正己烷进行淋洗，弃去淋洗液，再加入30ml二氯甲烷进行淋洗，用量筒接取30ml淋洗液，转移至鸡心瓶中，将该淋洗液置于旋转蒸发仪上进行旋蒸，旋蒸至2ml，将溶液转移到棕色小瓶中，用氮气柔和氮吹至干，待用；D、气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测：在上述棕色小瓶中加入1μl 10ppm六甲基苯作为内标，以及49μl的正己烷，进入气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测；色谱仪条件及质谱仪条件分别如下：色谱条件：DB-5(30m×0.25mm i.d.，0.25μm)或HP-5(30m×0.25mm i.d.，0.25μm)毛细管柱；载气为氦气，恒流，柱流量为1.0ml/min，无分流进样，进样量为1μl；进样口温度290℃；柱始温100℃(1min)，7℃/min升至160℃，3℃/min升至180℃，1℃/min升至190℃，10℃/min升至280℃，后运行300℃(5min)。质谱条件：电子电离(EI)源；离子源温度200℃，界面温度280℃；选择性离子分段扫描(SIM)，六甲基苯的扫描离子为m/z 147、162；佳乐麝香(HHCB)243、258、213；吐纳麝香(AHTN)243、258、201、159；酮麝香(MK)279、294；二甲苯麝香(MX)282、297；D10-菲188；溶剂切除时间8min；E、浓度计算：a、绘制标准曲线：分别用混标配制不同浓度的溶液；用四种目标合成麝香化合物，即佳乐麝香(HHCB)、吐纳麝香(AHTN)、酮麝香(MK)、二甲苯麝香(MX)四种目标化合物回收率指示物D10-菲，配制成浓度分别为10μg/l、20μg/l、40μg/l、100μg/l、200μg/l、500μg/l、1000μg/l七个不同浓度的标准样品溶液；并加入浓度为100μg/l的内标六甲基苯；将上述标准样品溶液进入气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测，测得各浓度点相应值；读出标准样品中这四个目标化合物的峰面积(S标目)以及内标化合物的峰面积(S标内)，将两者的比值，即相对响应值R＝S标目/S标内，并以R作为纵坐标，浓度C为横坐标，作为四个目标麝香化合物的标准曲线；b、浓度计算：主要采用内标法进行计算；通过前述母乳液的气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)的分离和分析，读出母乳液中各个目标化合物的峰面积(HHCB、AHTN、MK、MX)即S目，以及内标六甲基苯的峰面积即S内，S目与S内的比值即为响应值R，再根据对应的目标化合物的标准曲线的斜率a，求出对应的目标麝香化合物浓度C实际；具体计算公式如下：C＝R/a式中：C——浓度(单位：μg/l)R——相对响应值，R＝S目/S内a——相对应标准曲线的斜率为了保证消除背景干扰，根据上述公式，先计算出空白实验的浓度C空白，将C实际减去C空白的值，乘以样品定容的体积，再除以母乳脂肪恒重后所称得的重量，所得的结果就是母乳中合成麝香的浓度，即C样品浓度＝(C实际-C空白)×定容的体积(ml)/脂肪重量(g)；空白实验即用纯净水代替前述母乳进行上述四个步骤的预处理过程。