[发明专利]测定母乳中合成麝香浓度的方法

权利要求书

1.一种测定母乳中合成麝香浓度的方法，其特征在于具有以下的过程和步骤：

A、液液萃取和恒重脂肪：量取5ml母乳样品放入分液漏斗中，加入0.01μg回收率指示物D10-菲，随后加入8ml 8％的草酸钾和10ml乙醇充分摇匀，再加入5ml的乙醚振荡，将上述混合液进行液液萃取；先加入20ml正己烷，充分振荡，静置分层，待液面分层后，进行分液，取上层清液倒入鸡心瓶中，待用；将收集到的下层浑浊液再倒入分液漏斗中，加入10ml正己烷，充分振荡，静置分层，取上层清液倒入原待用的鸡心瓶中；下层浑浊液按上述同样方法逐级重复萃取两次，之后弃去下层浑浊液；将并和收集于原鸡心瓶中的澄清液置于旋转蒸发仪上进行旋蒸，旋蒸至体积2～3ml；然后转移至事先称重的棕色小瓶中，用氮气柔和氮吹至干，放于干燥器中恒重2天，将恒重的脂肪称量，记录下脂肪重量；

B、上凝胶色谱GPC柱处理：将上述恒重的脂肪用少量正己烷和二氯甲烷的混合液溶解，两者的体积比即正己烷∶二氯甲烷＝1∶1；然后过凝胶色谱GPC柱；该柱填料为Bio-BeadsS-X3凝胶，其作用是使母乳通过凝胶色谱GPC柱而分离去除其中的脂肪，淋洗液为165ml的正己烷和二氯甲烷按1∶1的体积比的混合液，用量筒接取前65ml的淋洗液，弃去，然后用100ml的量筒接取剩余的100ml淋洗液，将该淋洗液转移至鸡心瓶中，置于旋转蒸发仪上进行旋蒸，旋蒸至2ml，待用；

C、过硅胶小柱处理：将上述待用的2ml溶液过硅胶小柱处理，该柱中主要装有一定高度的硅胶，其作用主要是去除溶液中的杂质；先加入15ml正己烷进行淋洗，弃去淋洗液，再加入30ml二氯甲烷进行淋洗，用量筒接取30ml二氯甲烷淋洗液，转移至鸡心瓶中，将该淋洗液置于旋转蒸发仪上进行旋蒸，旋蒸至2ml，将溶液转移到棕色小瓶中，用氮气柔和氮吹至干，待用；

D、气相色谱-质谱联用仪检测：在上述棕色小瓶中加入1μl 10ppm六甲基苯作为内标，以及49μl的正己烷，进入气相色谱-质谱联用仪检测；

色谱仪条件及质谱仪条件分别如下：

色谱条件：30m×0.25mm i.d.，0.25μm的DB-5或30m×0.25mm i.d.，0.25μm的HP-5的毛细管柱；载气为氦气，恒流，柱流量为1.0ml/min，无分流进样，进样量为1μl；进样口温度290℃；柱始温100℃，保温1min，7℃/min升至160℃，3℃/min升至180℃，1℃/min升至190℃，10℃/min升至280℃，后运行300℃，保温5min；

质谱条件：电子电离源；离子源温度200℃，界面温度280℃；选择性离子分段扫描，六甲基苯的扫描离子为m/z 147、162；佳乐麝香243、258、213；吐纳麝香243、258、201、 159；酮麝香279、294；二甲苯麝香282、297；D10-菲188；溶剂切除时间8min；

E、浓度计算：

a、绘制标准曲线：分别用混标配制不同浓度的溶液；用四种目标合成麝香化合物，即佳乐麝香、吐纳麝香、酮麝香、二甲苯麝香四种目标化合物及回收率指示物D₁₀-菲，配制成浓度分别为10μg/l、20μg/l、40μg/l、100μg/l、200μg/l、500μg/l、1000μg/l七个不同浓度的标准样品溶液；并加入浓度为100μg/l的内标六甲基苯；将上述标准样品溶液进入气相色谱-质谱联用仪检测，测得各浓度点相应值；读出标准样品中这四个目标化合物的峰面积S_标目以及内标化合物的峰面积S_标内，将两者的比值，即相对响应值R＝S_标目/S_标内，并以R作为纵坐标，浓度C为横坐标，作为四个目标麝香化合物的标准曲线；

b、浓度计算：主要采用内标法进行计算；通过前述母乳液的气相色谱-质谱联用仪的分离和分析，读出母乳液中各个目标化合物的峰面积即S_目，以及内标六甲基苯的峰面积即S_内，S _目与S_内的比值即为响应值R，再根据对应的目标化合物的标准曲线的斜率a，求出对应的目标麝香化合物浓度C_实际；具体计算公式如下：

C＝R/a

式中：C——浓度，单位：μg/l

      R——相对响应值，R＝S_目/S_内

      a——相对应标准曲线的斜率

为了保证消除背景干扰，根据上述公式，先计算出空白实验的浓度C_空白，将C_实际减去C _空白的值，乘以样品定容的体积，再除以母乳脂肪恒重后所称得的重量，最终所得的结果就是母乳中合成麝香的浓度，即C_样品浓度＝(C_实际 -C_空白)×定容的体积ml/脂肪重量g；空白实验即用蒸馏水代替前述母乳进行上述五个步骤的预处理过程。