[发明专利]用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法

摘要

本发明提供了一种用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，该方法包括(1)表皮干细胞的制备：表皮细胞制成细胞悬液经IV型胶原粘附筛选后用表皮干细胞培养基进行培养；(2)去表皮真皮的制备；(3)组织工程皮肤的构建：取培养2～5代的表皮干细胞用Dispase酶消化有米粒至黄豆大小的细胞膜片浮起，将膜片接种至去表皮真皮上，加入组织培养基，进行液下液面培养得组织工程皮肤。采用本发明方法构建的组织工程皮肤更加符合人皮肤生物学特点。

主权项

1.一种用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，包括如下步骤(1)表皮干细胞的制备：取皮肤组织，以酶消化法配制浓度为1×106～2×106个细胞/ml的表皮细胞悬液，将细胞悬液接种至预铺了IV型胶原液的六孔培养皿内，将六孔培养皿置于5％CO2、37℃孵箱中培养10分钟使表皮干细胞贴壁，然后将液体和未贴壁的细胞吸出，在培养皿中加入表皮干细胞培养基继续培养，2～3天换液一次，待细胞长至70～80％融合时进行传代培养；(2)去表皮的真皮的制备：取健康成人皮肤标本，用PBS清洗标本表面附着物，常规消毒，去除标本皮下脂肪组织层，制成1×1cm2的皮片，浸于56℃PBS中30分钟，然后去除标本表皮，将去除表皮的标本密封后迅速置入液氮中5分钟，取出后室温放置30分钟，依此连续10个循环后，即得去表皮的真皮；(3)组织工程皮肤的构建：取培养2～5代的表皮干细胞用Dispase酶在37℃、5％CO2孵箱中消化20分钟，有细胞膜片浮起，将膜片平展接种至步骤(2)制备好的去表皮的真皮上，加入组织培养基，使液面略高于去表皮的真皮进行浸没培养，3～4天换液一次，7天后进行气一液面培养，培养4周后即得组织工程皮肤。