[发明专利]用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法

权利要求书

1.一种用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，包括如下步骤

(1)表皮干细胞的制备：取皮肤组织，以酶消化法配制浓度为1×106～2×106个细胞/ml的表皮细胞悬液，将细胞悬液接种至预铺了IV型胶原液的六孔培养皿内，将六孔培养皿置于5％CO2、37℃孵箱中培养10分钟使表皮干细胞贴壁，然后将液体和未贴壁的细胞吸出，在培养皿中加入表皮干细胞培养基继续培养，2～3天换液一次，待细胞长至70～80％融合时进行传代培养；

(2)去表皮的真皮的制备：取健康成人皮肤标本，用PBS清洗标本表面附着物，常规消毒，去除标本皮下脂肪组织层，制成1×1cm2的皮片，浸于56℃PBS中30分钟，然后去除标本表皮，将去除表皮的标本密封后迅速置入液氮中5分钟，取出后室温放置30分钟，依此连续10个循环后，即得去表皮的真皮；

(3)组织工程皮肤的构建：取培养2～5代的表皮干细胞用Dispase酶在37℃、5％CO2孵箱中消化20分钟，有细胞膜片浮起，将膜片平展接种至步骤(2)制备好的去表皮的真皮上，加入组织培养基，使液面略高于去表皮的真皮进行浸没培养，3～4天换液一次，7天后进行气一液面培养，培养4周后即得组织工程皮肤。

2.按照权利要求1所述的用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，其特征在于：制作表皮干细胞的皮肤组织取自包皮环切术后的皮肤。

3.按照权利要求1所述的用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，其特征在于：步骤(1)中所述传代培养为将前代培养的表皮干细胞分成3份，分别接种至预铺了IV型胶原的六孔培养皿中，将六孔培养皿置于5％CO2、37℃孵箱中培养10分钟使表皮干细胞贴壁，然后将液体和未贴壁的细胞吸出，在培养皿中加入表皮干细胞培养基继续培养，2～3天换液一次，待细胞长至70～80％融合时进行下代的传代培养。

4.按照权利要求1或3所述的用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，其特征在于：所述IV型胶原液中IV型胶原的浓度为0.5mg/ml。

5.按照权利要求1或3所述的用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，其特征在于：所述IV型胶原为人胎盘IV型胶原。

6.按照权利要求1所述的用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的酶消化法为将皮肤组织剪成宽2～4mm的细长条，以Dispase酶在4℃下消化16～18小时，然后将表皮与真皮分离，将分离后的表皮剪碎，在剪碎的表皮中加入含胰酶0.125％、乙二胺四乙酸0.1％的PBS液进行消化、离心，用KC-SFM液重悬细胞配制细胞悬液。

7.按照权利要求1所述的用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，其特征在于：步骤(1)中所述表皮干细胞培养基为：以KC-SFM为基础培养基，添加牛垂体提取物25μg/ml、霍乱毒素20ng/ml、非必需氨基酸0.1mmol/ml、hEGF 10ng/ml、bFGF 4ng/ml、胰岛素0.1μmol/L、青霉素100u/ml和链霉素100u/ml。

8.按照权利要求1所述的用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，其特征在于：步骤(3)中所述组织培养基为：以DMEM：F12为3∶1的体积比配制基础培养基，在基础培养基中添加牛垂体提取物25μg/ml、霍乱毒素20ng/ml、非必需氨基酸0.1mmol/ml、hEGF 10ng/ml、bFGF 4ng/ml、10％FBS、胰岛素0.1μmol/L、青霉素100u/ml和链霉素100u/ml。

9.按照权利要求1所述的用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，其特征在于：步骤(3)中每块真皮上接种两个表皮干细胞膜片，膜片并行排列。