[发明专利]甘蔗花叶病和宿根矮化病病原的多重PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种甘蔗花叶病和宿根矮化病病原的多重PCR检测方法，其特征是：(1)取甘蔗植株茎基部带鞘叶片为检测样品；(2)设计反转录引物和PCR检测引物对：cpc1、cpc2，RSD引物对F1、F2；对甘蔗花叶病毒和甘蔗宿根矮化病病原的基因片段进行扩增；(3)提取总核酸，将其中的RNA反转录成cDNA；(4)设计该一步法多重RT－PCR的反应体系和扩增程序，将核酸进行扩增；(5)利用凝胶电泳分析扩增结果及特异性，同时利用十倍递进稀释法检测该一步法多重RT－PCR的敏感度。本发明所提供的检测方法通过提取甘蔗的总核酸，在同一个PCR管中完成反转录及PCR反应就可以同时检测出这两种病害的病原，具有操作简单、节省时间、成本低、特异性和敏感性高等优点。

主权项

1.一种甘蔗花叶病和宿根矮化病病原的多重PCR检测方法，其特征在于：包括下列步骤：1)、在甘蔗植株上确定最佳检测取样部位：以待检测甘蔗植株茎基部带鞘叶片作为提取总核酸的材料；2)、根据公知的甘蔗花叶病毒中国大陆优势株系SCMV-A及其它四个株系SCMV-B、D、E、SC的核酸保守序列区设计反转录引物(5’-CCTTCATCTGCATG-3’)和PCR检测引物对：cpc1，cpc2；RSD引物对为F1，F2；用于扩增检测甘蔗花叶病病毒的基因片段大小为400bp，上游引物cpc1为5’-GAGTTTGATAGGTGGTATGAAGCC-3’，下游引物cpc2为5’-CCTTCATCTGCATGTGGGC-3’；用于扩增Lxx的基因片段的引物为已有引物：上游引物F1为5’-CTGGCACCCTGTGTTGTTTTC-3’，下游引物F2为5’-TTCGGTTCTCATCTC AGCGTC-3’，扩增的Lxx基因片段大小为265bp；3)、总核酸的提取及cDNA的合成：利用RNAplant试剂盒提取甘蔗总核酸：取约0.1g感病样品，液氮研磨至粉末后加入0.5ml 4℃的提取试剂，振荡至彻底混匀，室温放置5min后于4℃12000rpm离心10min，将上清转入新的无Rnase的离心管后加入0.1ml 5MNaCl，温和混均再加入0.1ml氯仿，上下颠倒数次混匀，然后4℃12000rpm离心10min，取上层水相转入新的无Rnase离心管后再加入等体积的异丙醇，混匀，温室放置10min，4℃12000rpm离心10min，弃上清，加1ml 75％乙醇，4℃5000rpm离心3min，弃上清，短暂离心然后用枪头吸出液体，室温晾干2-3min，加50ul无Rnase水溶解(加2ul RNasin Inhibitor)，于-70℃保存；利用RNA反转录试剂盒进行cDNA的合成：在PCR管中，加入如下样品：提取的总核酸样品4ul、Nuclease-free Water 10ul、SCMV反转录引物1ul、70℃热激5min后置冰浴上冷却2min、在管中继续加入Nuclease-free Water 1.5ul、5×RT Reaction Buffer 5ul、dNTP Mixter 1.25ul、RNasin 1.25ul、M-MLV RT1ul、将反应管42℃保温60 min、终止反应，反应液就是PCR反应中的cDNA模板；4)、一步法多重RT-PCR的扩增：建立一步法多重RT-PCR：通过不同反应条件PCR扩增效果的比较，该一步法多重RT-PCR反应体系设计为以“5+20”反应模式：即反转录物5ul+PCR反应试剂20ul，在同一个PCR管内进行反转录和多重PCR；反转录反应体系是：5×RT Reaction Buffer 1ul，反转录引物(RT)0.5ul，dNTPs 0.5ul，总核酸提取物1ul，RNAsafe0.25ul，M-MLV Reverse Transcriptase 0.25ul，Nuclease-free Water5ul；反应结束后立即在同一PCR管中加入20ul PCR反应试剂：Nuclease-free Water 12.35ul、10×PCR Buffer 2.5ul，dNTP Mixter2ul，RSD上下游引物各1ul，SCMV上下游引物各0.5ul，Taq DNA聚合酶0.15ul。PCR扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性20s，53℃退火30s，72℃ 45s，循环30次；最后72℃延伸5min；5)、琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果：用TAE电泳缓冲液配制1％琼脂糖凝胶，在TAE电泳槽中进行水平电泳，加10ul PCR扩增产物，以健康甘蔗总核酸的反转录物为模板的PCR产物为阴性对照，以DL2000 Marker为标准分子量，100v/85mA电泳40分钟，用凝胶成像系统拍摄电泳结果，若在265bp处出现扩增条带说明RSD为阳性，若在400bp处出现扩增条带说明SCMV为阳性，若在265bp和400bp均出现扩增条带说明RSD和SCMV均为阳性，无扩增条带说明RSD和SCMV均为阴性；6)、一步法多重RT-PCR特异性及敏感性检测：一步法多重RT-PCR敏感性检测：用分光光度计测定呈阳性的RSD、SCMV单一感染样品和混合感染的核酸，按十倍递进稀释法进行稀释，然后各取1ul进行一步法多重PCR，借助凝胶电泳观察结果，找出肉眼可见特异电泳条带所用核酸的最小临界值，依此得出一步法多重RT-PCR的敏感性。