[发明专利]甘蔗花叶病和宿根矮化病病原的多重PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种甘蔗病害的检测方法，主要是针对甘蔗花叶病病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)和甘蔗宿根矮化病(RatoonStunting Disease，RSD)病原细菌木质部赖氏杆菌木质部亚种(Leifsonia xyli subsp.Xyli，Lxx)的同时检测方法。

背景技术

甘蔗花叶病(Sugarcane mosaic virus，SCMV)和甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease，RSD)是两种世界范围内广泛发生的主要病害，它们在我国各蔗区也相当普遍和严重，所有的甘蔗栽培品种都受到不同程度的危害。

甘蔗花叶病由甘蔗花叶病毒引起，甘蔗花叶病毒是正单链RNA病毒，是马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属的重要成员之一，病毒株系繁多，变异较大。它主要危害甘蔗叶片，染病植株细胞内的叶绿体颗粒的发育受病毒抑制，在数目及体积上均逊于正常细胞，使叶组织发生透绿现象，尤以新叶基部症状最为明显，症状一般是黄绿相间不规则的嵌纹、条斑或斑驳。病斑长短大小不一，布满叶片，感病植株叶片黄化，植株矮化、分蘖减少。部分品种在夏季高温时症状会消失，即所谓“隐症”现象。宿根病蔗发芽缓慢，生长不良，还会表现出茎溃疡：即茎外皮发生水渍状条纹或斑块，外皮下组织先变紫红色，终致坏死而皱缩，由于坏死组织和健康组织生长不平衡，致茎外皮被推挤而破裂，形成所谓茎溃疡，感病株节间缩短。据调查，华南各地尤其是广西旱地甘蔗花叶病的发病率达到30％以上，产量损失3％-50％。

甘蔗宿根矮化病症状较隐蔽，易与干旱造成的损害症状相混，感病植株节间短缩、品质劣变，蔗汁中还原糖增加，蔗糖的结晶率降低。甘蔗宿根矮化病蔗株平均感染率50％左右，宿根年限愈长发病率愈高。该病通常造成甘蔗减产12％～37％，在干旱的情况下减产高达60％，蔗糖分降低0.5％(绝对值)，宿根性减弱，即使是无病无毒的健康种苗在生产上使用5年后也是100％感染宿根矮化病。

防止这两种病害的发生和蔓延对甘蔗产业的稳健发展十分重要。SCMV初期外观症状不明显，而RSD则无特异的外观症状，这给诊断这两种病害带来了困难。随着甘蔗健康种苗在甘蔗生产上的运用，迫切需要建立能稳定、准确、灵敏并能同时检测出这两种病原的检测方法，它可为甘蔗健康种苗的生产和应用、健康甘蔗种质资源交换、品种调运等提供有效的监控手段。

目前对SCMV的检测方法有：蔗株直观测定、生物测定、电镜诊断、血清学测定、核酸分子杂交、多聚酶链式反应(PCR)等检测方法，其中PCR是一种较为灵敏准确的检测方法。甘蔗RSD诊断技术经历了从内部症状观察(剖茎检视)、相差显微镜检查、免疫技术和PCR快速检测等4个阶段。由于特异性不明显，剖茎检视只能作为检测感染RSD的辅助标志；而如果含菌量低则用相差显微镜也不能检出；免疫技术检测则存在对Lxx数量密度要求较高(要求含菌量达10³～10⁷cells/ml以上)和假阴性或假阳性过高的问题；PCR技术能检测到含1-10个菌体的RSD，是较灵敏准确的检测方法。目前对甘蔗进行这两种病害的检测需要分两步PCR进行：提取甘蔗总RNA再通过RT-PCR方法检测SCMV；提取甘蔗的总DNA，再通过PCR方法检测RSD。这样检测较为烦琐，检测成本也很高。

发明内容

本发明的目的是提供一种甘蔗花叶病和宿根矮化病病原的多重PCR检测方法，它是在SCMV RT-PCR和RSD单一PCR检测体系的基础上，建立能同时检测这两种病原的一步法多重PCR检测方法。

本发明是集中一步法RT-PCR和多重PCR的优势，在已有RSD单一PCR检测体系的基础上，根据SCMV的中国大陆优势株系SCMV-A及其它四个株系SCMV-B、D、E、SC的保守序列区设计反转录引物和PCR检测引物对，建立并优化了一步法多重RT-PCR反应体系和反应程序，加快了诊断速度又节约了检测费用。