[发明专利]木霉菌突变株分生孢子的固体发酵方法

摘要

本发明涉及一种木霉菌突变株分生孢子的固体发酵方法。首先对限制性内切酶介导基因整合技术构建的木霉菌突变株进行稳定性检测，然后筛选出产孢量大、且对多种病原菌有较强抑制作用的生物工程突变株。单孢分离后转移至试管斜面内作母菌种，进而经马铃薯葡萄糖琼脂培养基、发酵种子液培养基培养获得二级菌种，再经优化的固体发酵方法使其产生分生孢子。发酵所用的固体发酵培养料由麦麸、腐殖酸钠、玉米渣、稻壳、稻草粉构成，通过优化固料配比和发酵条件，发酵所获得的孢子－基质混合物经干燥后可直接用于生产。本发明方法可产生大量的分生孢子，可直接用于保护地蔬菜生产，对由镰刀菌、立枯丝核菌等引起的土传病害有良好的防治效果。

主权项

1.一种木霉菌突变株分生孢子的固体发酵方法，其特征在于包括如下步骤：1)将在抗性培养基上生长的木霉菌单个菌落在含有220-260微克/毫升潮霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上转代3-4次，再移入不含有潮霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，经过7-8次转代培养，再移入含有230-260微克/毫升潮霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，将能够正常生长的菌株确定为稳定的突变株；将性状表现稳定的突变株进行单孢分离后，转移至试管斜面内保存作为母菌种；2)在无菌室内将木霉菌突变株母菌种转入马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，26-28℃下培养5-7天，用接种针刮下分生孢子，配成孢子量为(1-2)×106个/毫升的孢子悬液；3)取马铃薯200-250克、葡萄糖20-25克、MgSO4.7H2O 0.4-0.5克、FeSO4.7H2O0.0075克、MnSO4 0.0025克、ZnSO4 0.002克、KH2PO4 3.83克、NaNO3 1.42-1.50克、(NH4)2SO4 1.1-1.2克、CaCl2 1-1.25克，水1000毫升，配制成发酵种子液培养基，调节pH值为6-7，在121℃下灭菌20-30分钟，以1-1.5％的接种量向发酵种子液培养基接种孢子悬液，于摇床中振荡培养；培养条件是：27-28℃，140转/分，培养5-6天，获得二级菌种；4)配制固体发酵培养料，其组分以重量百分比计算为：麦麸∶腐殖酸钠∶玉米渣∶稻壳∶稻草粉＝15.0-16.0∶0.75-1.0∶3.0-3.5∶10-11∶10-11，固料与水的重量比为1-1.5∶0.5-1.0；固体发酵培养料在发酵罐中的厚度为6-8厘米，二级菌种的接种量为15-20％，培养温度为27-29℃，湿度为33-34％，通气量为20-25升/分钟，搅拌发酵5-7天，至固体发酵培养料变成绿色即获得木霉菌突变株分生孢子；5)将长满木霉菌突变株分生孢子的固体发酵培养料，在35-40℃下干燥后制备成菌剂。