[发明专利]木霉菌突变株分生孢子的固体发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种木霉菌突变株分生孢子的固体发酵方法，是一种促进限制性内切酶介导基因整合技术(restriction enzyme-mediated integration，REMI)构建的木霉菌突变株高产分生孢子的发酵方法。主要用于防治温室蔬菜土传病害。

背景技术

长期以来，蔬菜病害以化学防治为主，而频繁施用化学农药控制病害，不仅成本高，费工费时，而且造成蔬菜中农药过量残留，对人体健康和生态环境造成危害。因此开发高效生物农药具有重要意义。木霉菌为一类应用历史悠久的生物防治活性真菌，目前国际上已开发注册的木霉菌产品已有50余种，大多数都可用于防治作物土传病害或部分叶部病害和促进作物生长，然而在木霉菌应用过程中防效不稳定，持效性差。因此通过限制性内切酶介导的基因整合技术，创制木霉菌REMI突变株和优化相应的发酵工艺，进而研制出防病增产和修复环境的新型生物菌剂具有重要意义。由于木霉菌突变株容易出现菌丝生长过于旺盛，而产孢量不足的问题，而突变株分子孢子的产量与菌剂的质量密切相关，因此需要研究开发一种能够解决木霉菌REMI突变株高产分生孢子的方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种木霉菌突变株分生孢子的固体发酵方法，能产生大量的分生孢子，可直接用于开发高效木霉菌生物农药，有效防治植物土传病害。

为实现这一目的，本发明首先对限制性内切酶介导基因整合技术构建的木霉菌突变株进行稳定性检测，然后筛选出产孢量大、且对多种病原菌有较强抑制作用的生物工程突变株。单孢分离后转移至试管斜面内作母菌种，进而经马铃薯葡萄糖琼脂培养基、发酵种子液培养基培养获得二级菌种，再经优化的固体发酵方法使其产生分生孢子。发酵所用的固体发酵培养料由麦麸、腐殖酸钠、玉米渣、稻壳、稻草粉构成，通过优化固料配比和发酵条件，发酵所获得的孢子-基质混合物经干燥后可直接用于生产。

本发明的方法具体包括如下步骤：

1、突变株稳定性检测

将在抗性培养基上生长的木霉菌单个菌落在含有220-260微克/毫升潮霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上转代3-4次，再移入不含有潮霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，经过7-8次转代培养，再移入含有230-260微克/毫升潮霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，将能够正常生长的菌株确定为稳定的转化子。将性状表现稳定的突变株进行单孢分离后，转移至试管斜面内保存作为母菌种。

2、孢子悬液的制备

在无菌室内将木霉菌突变株母菌种转入马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，26-28℃下培养5-7天，用接种针刮下分生孢子，配成孢子量为(1-2)×10⁶个/毫升的孢子悬液。

3、二级菌种制备

取马铃薯200-250克、葡萄糖20-25克、MgSO₄.7H₂O 0.4-0.5克、FeSO₄.7H₂O 0.0075克、MnSO₄ 0.0025克、ZnSO₄ 0.002克、KH₂PO₄ 3.83克、NaNO₃ 1.42-1.50克、(NH₄)₂SO₄ 1.1-1.2克、CaCl₂ 1-1.25克，水1000毫升，配制成发酵种子液培养基，调节pH值为6-7，在121℃下灭菌20-30分钟，以1-1.5％的接种量向发酵种子液培养基接种孢子悬液，于摇床中振荡培养。培养条件是：27-28℃，140转/分，培养5-6天，获得二级菌种。

4、发酵液制备

配制固体发酵培养料，其组分以重量百分比计算为：麦麸∶腐殖酸钠∶玉米渣∶稻壳∶稻草粉＝15.0-16.0∶0.75-1.0∶3.0-3.5∶10-11∶10-11，固料与水的重量比为1-1.5∶0.5-1.0；固体发酵培养料在发酵罐中的厚度为6-8厘米，二级菌种的接种量为15-20％，培养温度为27-29℃，湿度为33-34％，通气量为20-25升/分钟，搅拌发酵5-7天，至固体发酵培养料变成绿色即获得木霉菌突变株分生孢子。

5、菌剂制备

将长满木霉菌突变株分生孢子的固体发酵培养料，在35-40℃下干燥后制备成菌剂。

取本发明发酵培养所得的菌剂6-8wt％与土壤或基质混合，在植物定植前后和生长期间，通过穴施、混土或随流灌根，可直接用于防治植物土传病害。