[发明专利]一种复制缺陷型重组腺病毒的构建方法

摘要

本发明涉及一种复制缺陷型重组腺病毒的构建方法。首先化学合成人APE1基因siRNA的双链表达模板，经酶切后插入到腺病毒穿梭质粒的U6启动子之下，构建穿梭质粒pDC316－EGFP－U6－APE1siRNA，后者与腺病毒骨架质粒pBHG－fiber5/35共转染293细胞，通过Cre/loxP系统作用发生定点重组获得含有人APE1基因siRNA表达序列的Ad5/F35－APE1siRNA重组腺病毒。该重组腺病毒能够有效抑制APE1基因的表达，可有效增强对肿瘤细胞放疗和化疗的敏感性。

主权项

1.一种复制缺陷型重组腺病毒的构建方法，包括如下步骤：1)、以基因编号为NM_001641的人APE1基因cDNA编码序列，根据siRNA靶序列遴选设计原则，经BLAST序列同源性分析后，选取人APE1基因cDNA编码序列中867-885共19nt的特异性siRNA靶序列，设计人APE1基因siRNA的表达序列，该序列如序列表中序列1，在上述序列的两端分别引入酶切位点粘端，化学合成带有酶切位点粘端的单链DNA片段及其互补单链DNA片段，将上述互补单链退火得到退火产物即人APE1基因siRNA的双链表达模板；2)、步骤1)所得人APE1基因siRNA的双链表达模板与腺病毒穿梭质粒经酶切后相连接，得到含有人APE1基因siRNA表达序列的腺病毒穿梭质粒；3)、将步骤2)得到的腺病毒穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞，经定点重组得到带有人APE1基因siRNA表达序列的重组腺病毒。