[发明专利]一种复制缺陷型重组腺病毒的构建方法

权利要求书

1.一种复制缺陷型重组腺病毒的构建方法，包括如下步骤：

1)、以基因编号为NM_001641的人APE1基因cDNA编码序列，根据siRNA靶序列遴选设计原则，经BLAST序列同源性分析后，选取人APE1基因cDNA编码序列中867-885共19nt的特异性siRNA靶序列，设计人APE1基因siRNA的表达序列，该序列如序列表中序列1，在上述序列的两端分别引入酶切位点粘端，化学合成带有酶切位点粘端的单链DNA片段及其互补单链DNA片段，将上述互补单链退火得到退火产物即人APE1基因siRNA的双链表达模板；

2)、步骤1)所得人APE1基因siRNA的双链表达模板与腺病毒穿梭质粒经酶切后相连接，得到含有人APE1基因siRNA表达序列的腺病毒穿梭质粒；

3)、将步骤2)得到的腺病毒穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞，经定点重组得到带有人APE1基因siRNA表达序列的重组腺病毒。

2.如权利要求1所述的构建方法，其中步骤1)所述的人APE1基因siRNA的表达序列含有APE1基因siRNA的特异性靶序列的正义链序列、反义链序列、连接正义链和反义链的9个碱基的Loop环序列及末端终止子序列。

3.如权利要求1所述的构建方法，其中步骤2)所述腺病毒穿梭质粒为pDC316-EGFP-U6。

4.如权利要求3所述的构建方法，其中步骤2)所述人APE1基因siRNA的双链表达模板连接于pDC316-EGFP-U6腺病毒穿梭质粒的U6启动子之下。

5.如权利要求1所述的构建方法，其中步骤3)所述骨架质粒为pBHG-fiber5/35。

6.如权利要求1所述的构建方法，其中步骤3)所述定点重组为pBHG-fiber5/35骨架质粒与带有loxP位点的腺病毒穿梭质粒pDC316-EGFP-U6配合，利用Cre/loxP系统的作用在293细胞内发生的定点重组。