[发明专利]重金属汞单克隆抗体的制备方法

摘要

本发明重金属汞单克隆抗体的制备方法，属于生物技术领域。专用于特异性识别重金属汞单克隆抗体的制备，及其在农产品和农业生产环境中汞残留的高灵敏快速检测。重金属汞离子与载体蛋白通过双功能金属螯合剂1－(4－异硫氰基苯基)－乙二胺四乙酸偶联形成完全抗原，用该完全抗原免疫Balb/C鼠，脾细胞和Sp2/0骨髓瘤细胞通过杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，获得了稳定分泌抗Hg－EDTA的单克隆抗体。本发明抗体的制备技术简便可行：抗原的整个制备过程无需要特别的仪器设备，容易工厂化规模生产。

主权项

1.汞单克隆抗体的制备方法，包括：1)免疫抗原制备：称取血蓝蛋白10mg溶于0.5ml浓度为10mM，pH9.0的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液中形成血蓝蛋白溶液；称取10mg金属螯合剂1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸溶于1ml二甲基亚砜中形成23nM金属螯合剂溶液；分别取148.5μl浓度为23nM的金属螯合剂溶液轻轻搅拌下逐滴滴加到0.5ml血蓝蛋白溶液中，用10M KOH调节pH至9.0，室温下反应24hr；反应产物用30Kd的超滤管纯化，超滤管预先用100mM乙二胺四乙酸浸泡，用超纯水充分冲洗后，超滤管内加入反应产物超滤，超滤管内先用10mM，pH9.0的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲洗3次，再用10mM，pH 7.4的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液洗2次除去其中未反应的小分子金属螯合剂，所得产物即为纯化的血蓝蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸溶液；0.0757g纯度为99.999％的汞颗粒溶于200μl优级浓硝酸，待充分溶解加超纯水使终体积为1ml，形成377.4mM汞溶液；取4.5μl浓度为377.4mM的汞溶液搅拌下逐滴滴加到纯化过的血蓝蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸中，用0.5M盐酸调节pH至7.0，室温下反应3小时，用上述30Kd的超滤管方法进行纯化去除未反应的金属离子，纯化后的产物分别为血蓝蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Hg，以所含蛋白量进行计量，以血蓝蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Hg作免疫原，浓度为12.5mg/ml；2)包被抗原的制备：称取牛血清白蛋白10mg溶于1.4ml浓度为0.15mM，pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中形成牛血清白蛋白溶液，终浓度为7.14mg/mL；称取5mg谷胱甘肽溶于1mL超纯水中，终浓度为5mg/mL；称取0.15g氨基乙酸溶于2mL超纯水中，终浓度为1mol/L；用0.15mM，pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释戊二醛使终浓度为0.2％；在磁力低速搅拌下，0.6mL谷胱甘肽逐滴加入到1.4mL牛血清白蛋白溶液中，然后向反应液中逐滴加入0.2％戊二醛2mL，室温下搅拌反应2h。上述物质充分反应后，磁力搅拌下逐滴加入1mL氨基乙酸溶液，调节pH至7.2，室温搅拌反应2h。用0.15mM，pH7.4磷酸盐缓冲液透析24h；0.0757g纯度为99.999％的汞颗粒溶于200μl优级浓硝酸，待充分溶解加超纯水使终体积为1ml，形成377.4mM汞溶液，用超纯水将377.4mM汞溶液稀释成1mM的汞溶液；取50μL浓度为1mM的汞溶液搅拌下逐滴滴加到纯化过的牛血清白蛋白-谷胱甘肽中，用0.5M盐酸调节pH至7.0，室温下反应3小时，经PBS过夜透析纯化后为牛血清白蛋白-谷胱甘肽-Hg，以所含蛋白量进行计量，以牛血清白蛋白-谷胱甘肽-Hg作为包被抗原，浓度为9mg/mL；3)小鼠免疫：将制备好的血蓝蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Hg作为免疫原免疫6-8周龄雌性BalB/c鼠，每次每只小鼠的免疫原用量200μg，共免疫五次，第一次免疫间隔3周，采用由等体积的免疫原和佛氏完全佐剂乳化，腹腔注射，以后四次免疫间隔2周用等体积的佛氏不完全佐剂和免疫原乳化；从第三次开始，每次免疫后一周，鼠尾静脉采血用间接非竞争ELISA法检测抗体的特异性，用pH 7.4的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液稀释牛血清白蛋白-谷胱甘肽-Hg至9μg/ml，包被96孔酶联微量分析板，4℃放置过夜或37℃2小时；用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤3次；用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液稀释明胶至1％，100μl/孔，37℃放置1.5小时；含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤3次；加入相同数量的血清50μl/孔，37℃1小时；用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤3次；磷酸盐缓冲液溶液1000倍稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，50μl/孔，37℃1小时；含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；四甲基联苯胺50μl/孔，37℃显色10分钟；加25μl/孔的2M硫酸终止反应，酶联仪上450nm处读数，第三次免疫后，1号BalB/c鼠效价达1∶8000，4号BalB/c鼠效价达1∶4000，2号和3号BalB/c鼠效价不明显；四免后四只BalB/c鼠均有效价，其中1号BalB/c鼠效价最高，达1∶20000，2、3、4号BalB/c鼠效价分别达1∶4000、1∶4000、1∶8000，再次免疫后效价均不再升高，选取效价达1∶20000一号BalB/c鼠脾细胞做融合；4)细胞融合：选取效价达1∶20000一号BalB/c鼠用pH 7.4的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液稀释血蓝蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸-Hg直接免疫，三天后取脾脏，脾细胞和对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞通过杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，37℃，5％二氧化碳培养箱培养10-14天后，通过检测融合孔上清筛选杂交瘤细胞；5)杂交瘤筛选：融合孔上清用与筛选小鼠的方法相同都采用间接非竞争ELISA法进行初步筛选，用pH7.4的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液稀释牛血清白蛋白-谷胱甘肽-Hg至9μg/ml，包被96孔酶联微量分析板上，4℃过夜或37℃放置2小时；用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤3次；含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液稀释明胶至1％，100μl/孔，37℃放置1.5小时；含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤3次；加入相同数量的融合孔上清50μl/孔，以空白孔调零，用SP2/0的上清作阴性对照，37℃1小时，含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤3次；加入磷酸盐缓冲液溶液1000倍稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠，50μl/孔，37℃1小时；含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；四甲基联苯胺50μl/孔，37℃显色10分钟；加25μl/孔的2M硫酸终止反应，酶联仪上450nm处读数，用血清白蛋白-谷胱甘肽-Hg包被的读数且大于SP2/0读数的2.1倍，这样的融合孔即为阳性孔，阳性孔通过有限稀释法进行亚克隆，阳性孔分泌的上清即为所制备汞单克隆抗体；由于金属离子汞是小分子既不具有免疫原性，单独的汞离子不具有抗原表位；必须借助螯合剂谷胱甘肽形成半抗原与抗体反应，为了进一步确定得到阳性孔所分泌抗体是针对金属汞，再通过竞争ELISA法筛选阳性孔，用牛血清白蛋白-谷胱甘肽-汞50μl/孔包被酶标板，4℃放置过夜，0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤3次；0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液稀释明胶至1％(m/v)，100μl/孔，37℃1.5小时；0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤3次；用含1mM谷胱甘肽的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液将浓度为1g/L硝酸汞标准溶液稀释成0.005mM，0.05mM，0.5mM，室温下反应45分钟，再与等体积的融合孔上清充分混匀室温反应45分钟，50μl/孔加入到酶联板上，37℃1小时；0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤3次；磷酸盐缓冲液溶液1000倍稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，50μl/孔，37℃1小时；0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次； 四甲基联苯胺底物溶液50μl/孔，37℃10分钟，加入25μl/孔2M的硫酸终止反应，酶联仪上450nm处读数，以空白对照调零，以Sp2/0骨髓瘤细胞上清液为阴性对照，以融合孔上清液为阳性对照，待测孔在450nm处的值大于或等于阴性孔的2.1倍定为阳性。