[发明专利]重金属汞单克隆抗体的制备方法

说明书

(一)技术领域

本发明是重金属汞单克隆抗体的制备方法，属于生物技术领域。专用于特异性识别重金属汞的单克隆抗体制备，以及农产品和农业生产环境中重金属残留的高灵敏快速检测，特别适用于大批量样品检测和现场监测。

(二)背景技术

重金属汞是自然界存在的一种重要的金属元素。由于具有多种优良特性，汞及其化合物在工农业生产中应用十分广泛。然而，汞是一种对人体和高等生物具有很强毒性的金属污染物。早在20世纪50年代日本熊本水俣病爆发之后，汞的污染问题就引起了人们的关注。近年来，随着城市化进程的不断加快和工业化水平的迅速提升，由于生产、生活所致的汞及其化合物污染日趋严重并再度成为全球热点问题之一。

当前，含汞颗粒物的大气沉降、农用含汞杀菌剂的大量使用、工业及生活含汞废水的排放等不仅使生态环境中汞污染现象十分严重，造成农产品中重金属污染超标，严重影响我国农产品质量和国际竞争力，而且还严重危害人类的身体健康。汞对人体的危害主要表现在导致肾损伤(以无机汞(HgCl₂)形式存在)、中枢神经系统紊乱、智障、甚至死亡(以有机汞CH₃Hg⁺、(CH₃)₂Hg形式存在)。汞污染和其它重金属污染往往会造成二种或多种重金属元素的复合污染，并具有普遍性、复杂性等特点，给生态环境带来了更大的压力。因此，有关汞的排放、迁移、沉降以及控制研究已成为环境污染防治的新兴领域之一。联合国粮农组织和世界卫生组织已于1963年规定了食品中汞的最大允许浓度为0.05mg/kg(鲜重)，美国为0.5mg/kg，我国食品卫生标准规定的汞极限值为0.02mg/kg。

传统的重金属检测方法多采用化学仪器检测，如利用原子吸收光谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法、离子色谱仪、X射线荧光光谱法、气相色谱-质谱联用法等，检测仪器昂贵，这些检测方法虽然能够精确测量样品中单种金属的总量，但检测相对费时、费力、费用昂贵，需要进行大量的样品预处理，且样品的检测需在大型分析设备的室内进行，不适应实践中快速简便灵敏的需要。

重金属的免疫检测方法具有快速、廉价、简便、灵敏、特异的优点，可便携而进行现场监测。克服了传统检测方法的缺点。通过化学合成高选择性重金属离子捕获螯合剂，制备重金属离子螯合物，与载体蛋白偶联获得完全抗原，制备针对环境和农产品中重金属离子螯合物特异性的单克隆抗体。建立重金属离子螯合物免疫学检测方法，该方法的完成，将解决重金属螯合、偶联、单克隆抗体制备等关键技术，建立重金属离子螯合物的免疫学快速检测技术。该专利不仅为食品安全检测，而且为我国农产品等的出入境检测、环境监测部门的水域监测提供有效的技术手段和检测方法。重金属残留的免疫学快速检测试剂盒的开发将会实现很好的经济效益。对我国农产品的可持续健康发展、解决食品安全问题具有重要的现实意义和重要的社会、经济价值。我国在这方面起步较晚，只是在近几年才有单位和研究人员重视并从事重金属免疫速测技术研究，目前国内尚未见该类方法的研究报道。

(三)发明内容

技术问题 本发明的目的是提供汞单克隆抗体的制备方法，通过合成汞抗原，免疫BalB/C鼠，通过杂交瘤技术制备特异性强的汞单克隆抗体，并用于农产品和农业生产环境中重金属残留的高灵敏快速检测。

技术方案

1、汞单克隆抗体的制备方法，包括：

1)免疫抗原制备：

称取血蓝蛋白(KLH)10mg溶于0.5ml浓度为10mM，pH9.0的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液中形成血蓝蛋白溶液；

称取10mg金属螯合剂1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸(日本同仁化学研究所的产品，下同)溶于1ml二甲基亚砜中形成23nM金属螯合剂溶液；

分别取148.5μl浓度为23nM的金属螯合剂溶液轻轻搅拌下逐滴滴加到0.5ml血蓝蛋白溶液中，用10M KOH调节pH至9.0，室温下反应24hr；

反应产物用30Kd的超滤管(Millipore Co.下同)纯化，超滤管预先用100mM乙二胺四乙酸浸泡，用超纯水充分冲洗后，超滤管内加入反应产物超滤，超滤管内先用10mM，pH9.0的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲洗3次，再用10mM，pH7.4的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液洗2次除去其中未反应的小分子金属螯合剂，所得产物即为纯化的血蓝蛋白-1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸溶液；