[发明专利]同时获得副产物普鲁兰的β-聚苹果酸的制备方法

摘要

本发明公开了一种同时获得副产物普鲁兰的β-聚苹果酸制备方法。利用本方法能够有效去除黑色素，提高产物纯度；可减少由于普鲁兰随黑色素的废弃而引起的环境污染。本发明通过下述技术方案予以实现：将出芽短梗霉菌种经活化和种子培养后接种于发酵培养基中；在24-30℃，和120rpm条件下培养8-14天，发酵结束后，固液分离，除去菌体。加等体积乙醇分离出普鲁兰沉淀和黑色素，澄清液浓缩后加二倍体积乙醇离心再次分离普鲁兰。二次浓缩。加四倍体积的乙醇沉淀β-聚苹果酸，并再次溶于水中，透析或超滤除去残留黑色素和一些小分子物质，冷冻干燥获得β-聚苹果酸成品。分离出的普鲁兰溶于乙醇/丁酮混合液中，除去黑色素，经透析后冷冻干燥获得普鲁兰。

主权项

1.同时获得副产物普鲁兰的β-聚苹果酸的制备方法，包括以下步骤：第一步，培养基的配制①活化培养基：即马铃薯蔗糖培养基(PSA)：马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，pH5.6，121℃高压蒸汽灭菌30分钟；②发酵培养基的配制：葡萄糖120g/L，NaNO3 2g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KCl 0.5g/L，CaCO3 30g/L，pH4.0，121℃高压蒸汽灭菌15分钟，CaCO3单独干热灭菌，180℃2小时；第二步，菌种活化将冻干菌种——出芽短梗霉(Aureobasidium pullulan，As3.837)采用PSA在22-26℃进行活化培养40-90小时；第三步，种子培养在固体平板上挑取第二步制得的活化单菌，接种于装有第一步制得的发酵培养基的L管中，在24-30℃，120r/min条件下振荡培养40-100小时；第四步，接种发酵将第三步制得的种子培养物以0.8-2％接种于发酵培养基中，在24-30℃，120r/min条件下振荡培养发酵8-14天；第五步，分离纯化①β-聚苹果酸与普鲁兰的初步分离：在第四步发酵结束后，离心，固液分离，除去菌体；将发酵液调节pH至5.0，加等体积乙醇，黑色絮状沉淀即为吸附了黑色素的普鲁兰，淡黄色澄清液即为溶β-聚苹果酸液；过滤分离；将溶β-聚苹果酸液浓缩后加二倍体积乙醇，出现的少量絮状沉淀为普鲁兰，过滤并入初次沉淀的普鲁兰中；二次旋蒸浓缩上清液，得到较为纯化的β-聚苹果酸浓缩液；②β-聚苹果酸的纯化：将上面①浓缩后的β-聚苹果酸溶液加4倍体积乙醇，置于4℃冰箱过夜，有白色沉β-聚苹果酸沉淀析出；再次溶于50-100倍重量的水中，透析或超滤2天，去除β-聚苹果酸中的黑色素和一些小分子物质，冷冻干燥，得PMA白色粉末产物；③普鲁兰的纯化：配制乙醇/丁酮比例6∶4的混合溶剂，将上面①得到的普鲁兰与5-15倍该溶剂混合，搅拌2天，使普鲁兰与黑色素充分分离；将普鲁兰粗品溶于水中，用常规透析方法透析除去残留的黑色素；将经过纯化的普鲁兰溶液冷冻干燥，得副产物微黄色普鲁兰固体。