[发明专利]同时获得副产物普鲁兰的β-聚苹果酸的制备方法

说明书

技术领域

本发明的技术方案属于生物法合成生物降解高分子材料研领域。

背景技术

生物降解聚酯的合成研究始于20世纪60年代。1969年，研究圆弧青霉菌(Pencillium cyclopium)的微生物学家Shimada和Matsushima等推测该菌中可能存在含苹果酸结构单元的聚合物，该聚合物能够抑制圆弧青霉菌的酸性蛋白酶活性，最终证实该聚合物为聚苹果酸(PMA)。1979年，Vert等首次合成了水溶性脂肪族聚酯——聚苹果酸，它以苹果酸为唯一单体。1989年，Fisher等从黏菌(Physarum Polycephalum)细胞中分离出PMA，并发现它是DNA聚合酶α的抑制剂。迄今为止，以Vert、Cammas、Kajiyama等为代表的国外学者已对PMA的合成、性能和应用做了较深入的研究；国内直到近几年才有学者对PMA的合成与性能做了基础研究。

聚苹果酸(PMA)是一种脂肪族聚酯类聚合物，是完全生物降解性的新型生物高分子。PMA能被某些微生物先降解为低聚物，而后形成苹果酸单体，并最终降解为CO₂和H₂O，其降解产物无毒无害，不会对环境产生二次污染，是一种理想的生物降解性材料。PMA主要有α、β、γ三种结构，存在于生物体内的主要是β型，它具有良好的水溶性、可生物降解性、生物相容性和生物可吸收性，而且它具有易代谢性和易修饰性。因此，β-PMA可以作为药物载体及微胶囊材料、生物医学材料，如手术缝合线和绷带等，还可作为化妆品、食品包装材料等。

普鲁兰是出芽短梗霉产生的一种胞外多糖副产物，易溶于水，不溶于乙醇。它是一种具有极好的成膜、成纤、阻气、粘接、无毒性生物高分子，已广泛应用于生物医药和食品等领域。

PMA的制备主要有化学合成法和生物发酵法两种。研究伊始，其合成方法主要集中于化学合成法，又分为直接聚合法和开环聚合法两种。直接聚合法得到的主要是γ型PMA，并且相对分子质量比较低，实际应用价值较小，而且催化剂有毒，较难分离得到产物。开环聚合法又分为交酯和内酯开环法，交酯开环得到的是α型PMA，内酯开环法可得到β型PMA，但该方法形成内酯的步骤较多、不经济或产率太低。生物发酵法可得到β型PMA，并且分子量相对较大，所需的原料简单易得，反应条件温和，具有较大的开发应用前景。但是，长期以来，微生物法制备聚苹果酸的研究国际国内均处在实验室水平，并存在PMA产量低、分离纯化困难和黑色素难以去除的问题，而且，由于忽视了副产物普鲁兰的分离纯化，使聚苹果酸的制造成本高居不下，又引起环境问题。事实上，构建聚苹果酸生产用基因工程菌是解决产物分离纯化问题最好的方法。然而，在高产聚苹果酸基因工程菌构建还没有实现的情况下，副产物普鲁兰的去除一直是聚苹果酸生产需要高度重视的问题之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种同时获得副产物普鲁兰的β-聚苹果酸的制备方法，实现β-聚苹果酸和普鲁兰的双产物发酵，有效去除黑色素，减少由于副产物普鲁兰废弃造成的环境污染。

本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：

第一步，培养基的配制

①活化培养基：即马铃薯蔗糖培养基(PSA)：马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，pH5.6，121℃高压蒸汽灭菌30分钟；

②发酵培养基的配制：葡萄糖120g/L，NaNO₃ 2g/L，KH₂PO₄ 0.1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，KCl 0.5g/L，CaCO₃ 30g/L，pH 4.0，121℃高压蒸汽灭菌15分钟，CaCO₃单独干热灭菌，180℃2小时；

第二步，菌种活化

将冻干菌种——出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans，As3.837)采用PSA在22-26℃进行活化培养40-90小时；

第三步，种子培养

在固体平板上挑取第二步制得的活化单菌，接种于装有第一步制得的发酵培养基的L管中，在24-30℃，120r/min条件下振荡培养40-100小时；

第四步，接种发酵

将第三步制得的种子培养物以0.8-2％接种于发酵培养基中，在24-30℃，120r/min条件下振荡培养发酵8-14天；

第五步，分离纯化