[发明专利]鸡传染性贫血病毒抗体斑点免疫胶体金渗滤试验检测方法

摘要

本发明公开了一种鸡传染性贫血病毒抗体斑点免疫胶体金渗滤试验检测方法，首先取1uL CAV层析抗原点在NC膜(0.45μm硝酸纤维素膜)斑点中央，室温下自然干燥0.5h，用PBS洗3min、除去未吸附上的抗原；将点样后的NC膜浸于封闭液(0.01Mol/L、pH7.4 PBS，含5％BSA、0.5％Tween－20)中，37℃作用下30min，用PBS洗3min、除去未吸附的封闭液、凉干；加待检血清标本100uL于NC膜的点样处，37℃作用下30min；加金标兔抗鸡IgG 100UL，37℃作用下15min，用去离子水洗3min；NC膜浸入硝酸银显影液中、室温下避光作用10min，移入定影液中、室温下作用5min，然后用去离子水冲洗，自然干燥后观察结果。若与金标抗体作用20min，经银染色后NC膜上呈现红色斑点的则为阳性、黑色斑点为强阳性，否则为阴性。本发明对CAV进行临床诊断不仅切实可行，且具有快速、准确、特异的优点，满足了临床诊断的要求，为检测CAV抗体提供了便利条件。

主权项

1.一种鸡传染性贫血病毒抗体斑点免疫胶体金渗滤试验检测方法，其特征是，按照下述步骤进行：(1)点样：取1uL鸡传染性贫血病毒(CAV)层析抗原点在NC膜斑点中央，室温下自然干燥0.5h，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3min、除去未吸附上的抗原；其中CAV层析抗原按照下述步骤制备：a、CAV VP1基因的克隆及原核表达载体的构建：根据发表的CAV VP1基因组序列分别设计引物，以CAV天津分离TJBD 33株为模板，采用聚合酶链式反应方法扩增出690bp的DNA片段；将扩增的DNA片段纯化后克隆至pGM-TEasy载体中构建重组克隆质粒；通过酶切、克隆将CAV VP1基因片段分别插入原核表达载体，转化感受态大肠杆菌DH5α，用聚合酶链式反应方法挑选阳性菌落，培养后提取表达CAV VP1基因的重组质粒；b、CAV VP1表达蛋白的制备：将上述阳性菌落接种于Luria-Bertani(LB)液体培养基中培养至OD600值为0.6，然后加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)于26℃条件下诱导3.5h，获得表达CAV VP1蛋白的菌体；培养表达重组蛋白的细菌，裂解后用几丁柱方法进行纯化，得到CAV层析抗原；(2)封闭：将点样后的NC膜浸于封闭液中，封闭液为0.01Mol/L、pH7.4的PBS溶液，PBS溶液中含5％牛血清白蛋白(BSA)、0.5％吐温-20(Tween-20)，在37℃下作用30min，用PBS溶液洗3min、除去未吸附的封闭液后晾干；(3)加待检血清：加待检血清标本100uL于NC膜的点样处，37℃下作用30min；(4)加金标抗体：加金标兔抗鸡免疫球蛋白(IgG)100uL，37℃作用下15min，用去离子水洗3min；其中金标兔抗鸡免疫球蛋白(IgG)按照下述步骤制备：a、胶体金颗粒的制备：分别按要求制备A液和B液；A液：1％HAuCl4 水溶液1mL加入79mL双馏水中混匀；B液：1％枸橼酸三钠4mL，0.1Mol/LK2CO3 0.025mL，1％鞣酸0.1mL，双馏水15.875mL；将A液、B液分别加热至60℃，在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌、煮沸直至溶液呈亮红色且颜色再不发生变化为止，室温下冷却，分装为每份1mL保存于4℃；b、金标兔抗鸡IgG的制备与纯化：分别取10mL上述胶体金溶液和兔抗鸡IgG抗体，并将胶体金和兔抗鸡IgG抗体溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0，在电磁搅拌下将兔抗鸡IgG抗体溶液，加入胶体金溶液混合，搅拌10min，并加入一定量5％BSA使溶液终浓度为1％，以防止兔抗鸡IgG抗体与胶体金聚合发生沉淀；将胶体金兔抗鸡IgG结合物先1500r/min 4℃离心30min，弃掉由凝聚形成的沉淀；将上清液于4℃、15000r/min离心1h，小心吸取上清液并弃掉，取沉淀；将沉淀物用含1％BSA、0.05％NaN3的0.01Mol/L pH8.2的PB液重悬沉淀至原量，于4℃下平衡过夜，然后重复4℃、15000r/min离心1h一次，再将沉淀物重悬为原来体积的1/5，分装为每份10mL后于4℃保存；(5)银加强染色：NC膜浸入硝酸银显影液中、室温下避光作用10min，移入定影液中、室温下作用5min，然后用去离子水冲洗，自然干燥后观察结果；(6)结果判定：若与金标抗体作用20min，经银染色后NC膜上呈现红色斑点的则为阳性、黑色斑点为强阳性，否则为阴性。