[发明专利]鸡传染性贫血病毒抗体斑点免疫胶体金渗滤试验检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，更具体地说，是涉及一种鸡传染性贫血病毒抗体斑点免疫胶体金渗滤试验(DIGFA)检测方法。

背景技术

鸡传染性贫血病(Chicken Infectious Anemia，CIA)是鸡传染性贫血病毒(Chicken Anemia Virus，CAV)引起的一种以再生障碍性贫血和全身淋巴器官萎缩，造成免疫抑制为主要特征的病毒性传染病。其病原一鸡传染性贫血病毒1979年由日本学者Yuasa等首次报道以后，相继在西德、瑞典、英国、丹麦、波兰、美国、澳大利亚、荷兰及巴西等国陆续证实了本病的发生。我国于1992年首次分离到此病毒。CAV为环状单股DNA病毒，在国际病毒分类委员会(ICTV)发表的第六次病毒分类报告中将其与猪环状病毒、鹦鹉喙羽病病毒一起设立了一个新科，即圆环病毒科(Circoviridae)。

目前可以用于鸡传染性贫血的诊断方法主要有：CAV病毒的分离和鉴定、电镜观察、免疫荧光或过氧化物酶染色法和聚合酶链式反应(PCR)方法等。上述方法都需要荧光显微镜、酶标仪、PCR仪等昂贵的仪器设备，反应条件相对苛刻，再加上操作步骤繁琐，试验时间长等，因而使其在基层的应用受到一定的局限性。鉴于上述原因，研究新的快速、敏感、特异、简便、容易操作的CAV检测技术就显得十分必要，也是当前亟待解决的问题，这对于加强该病的诊断和预防研究具有极为重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术中存在的不足，提供一种快速、简便、敏感性高的鸡传染性贫血病毒抗体斑点免疫胶体金渗滤试验检测方法。

本发明鸡传染性贫血病毒抗体斑点免疫胶体金渗滤试验检测方法，通过下述步骤予以实现：

(1)点样：取1uL鸡传染性贫血病毒(CAV)层析抗原点在NC膜斑点中央，室温下自然干燥0.5h，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3min、除去未吸附上的抗原；

其中CAV层析抗原按照下述步骤制备：

a、CAV VP1基因的克隆及原核表达载体的构建：根据发表的CAV VP1基因组序列分别设计引物，以CAV天津分离TJBD33株为模板，采用聚合酶链式反应方法扩增出690bp的DNA片段；将扩增的DNA片段纯化后克隆至pGM-T Easy载体中构建重组克隆质粒；通过酶切、克隆将CAV VP1基因片段分别插入原核表达载体，转化感受态大肠杆菌DH_5α，用聚合酶链式反应方法挑选阳性菌落，培养后提取表达CAV VP1基因的重组质粒；

b、CAV VP1表达蛋白的制备：将上述阳性菌落接种于Luria-Bertani(LB)液体培养基中培养至OD600值为0.6，然后加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)于26℃条件下诱导3.5h，获得表达CAV VP1蛋白的菌体；培养表达重组蛋白的细菌，裂解后用几丁柱方法进行纯化，得到CAV层析抗原；

(2)封闭：将点样后的NC膜浸于封闭液中，封闭液为0.01Mol/L、pH7.4的PBS溶液，PBS溶液中含5％牛血清白蛋白(BSA)、0.5％吐温-20(Tween-20)，在37℃下作用30min，用PBS溶液洗3min、除去未吸附的封闭液后晾干；

(3)加待检血清：加待检血清标本100uL于NC膜的点样处，37℃下作用30min；

(4)加金标抗体：加金标兔抗鸡免疫球蛋白(IgG)100uL，37℃作用下15min，用去离子水洗3min；

其中金标兔抗鸡免疫球蛋白(IgG)按照下述步骤制备：

a、胶体金颗粒的制备：分别按要求制备A液和B液；A液：1％HAuCl₄水溶液1mL加入79mL双馏水中混匀；B液：1％枸橼酸三钠4mL，0.1Mol/LK₂CO₃0.025mL，1％鞣酸0.1mL，双馏水15.875mL；将A液、B液分别加热至60℃，在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌、煮沸直至溶液呈亮红色且颜色再不发生变化为止，室温下冷却，分装为每份1mL保存于4℃；