[发明专利]一种胞外胆固醇氧化酶产生菌的分离方法

摘要

一种胞外胆固醇氧化酶产生菌的分离方法，其特点是从自然环境、肉制品以及肉食动物新鲜粪便中分离产生胞外胆固醇氧化酶的菌株。该方法包括以下步骤：a.采集土样或水样等样品，接种在以胆固醇为唯一碳源的液体分离培养基中，富集培养；b.利用稀释涂平板的方法，在固体分离培养基上纯化菌落；c.在发酵培养基中发酵培养，用醋酸乙酯萃取发酵液，用硅胶薄板层析分析萃取液中胆甾－4－烯－3－酮的产量，筛选胆甾－4－烯－3－酮产量高的菌株；d.选取胆甾－4－烯－3－酮高产菌株进一步发酵培养，检测其发酵上清液的胆固醇氧化酶酶活性，从而筛选得到能产生胞外胆固醇氧化酶的菌株。

主权项

1.一种胞外胆固醇氧化酶产生菌株的分离方法，其特征在于，该分离方法包括如下步骤：(1)采集鱼、鸡、猪、羊、牛肉制品、肉食动物新鲜粪便以及富含胆固醇的自然或人工环境土样或水样，接种至以胆固醇为唯一碳源的液体富集培养基中，于温度30-37℃，振荡富集，培养3-4天；取200μl培养液至新鲜的液体分离培养基中按照上述条件，重复3次，消除样品中所含碳源的干扰；(2)取上述培养悬液200μl用无菌水稀释到10-5、10-6、10-7、、10-8、10-9 5个浓度梯度，分别涂布于固体分离培养基上，于温度30-37℃培养3-4天，将出现的菌落接种牛肉膏蛋白胨培养基斜面上培养保存；(3)将斜面上保存的菌株活化后，在3ml发酵培养基中，30-37℃振荡培养48h，取发酵液，加入等体积的醋酸乙酯混匀后，静置过夜，取上层萃取液，在硅胶薄板上点样，室温下展开自然干燥后，于254nm紫外灯下观察，硅胶薄板上出现黑色无荧光斑点者为胆固醇氧化酶催化胆固醇产生的胆甾-4-烯-3-酮，选取黑色无荧光斑点较大的菌株进行下一步筛选；(4)选取胆甾-4-烯-3-酮高产菌株进一步液体发酵培养48h，检测其发酵上清液的胆固醇氧化酶酶活性，从而筛选得到能产生胞外胆固醇氧化酶的菌株。