[发明专利]一种胞外胆固醇氧化酶产生菌的分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种胞外胆固醇氧化酶产生菌的分离方法，属于应用微生物技术领域。

技术背景

胆固醇氧化酶(cholesterol oxidase，COD)能将胆固醇转变为胆甾-4-烯-3-酮，同时产生过氧化氢(H₂O₂)，H₂O₂在过氧化物酶的作用下分解，可使4-氨基-安替比林与苯酚形成亚醌类呈红色的化合物，在500 nm处有最大吸收峰，通过测量反应液在500m处的吸光度，可定量测定胆固醇被氧化的量(Richmond W. 1973，Preparation and properties of a cholesterol oxidase from Nocardia sp.and itsapplication to the enzymatic assay of total cholesterol in serum.Clin Chem19，1350-1356)。近年来，医学研究证明血清高胆固醇与心脏病、动脉粥样硬化、糖尿病、肝胆疾病等人类疾病有关(MacLachlan J，Wotherspoon AT，Ansell RO，Brooks CJ.2000，Cholesterol oxidase：sources，physical properties and analyticalapplications.J Steroid.Biochem Mol Biol.72：169-195)。临床上方便、准确地检测血液和食品中的胆固醇含量非常重要，对于糖尿病监测和糖尿病并发症的预防、心脑血管疾病诊断与预防等有着极其重要的作用(Aihara H，Watanabe K，Nakamura R.1 988，Degradation of cholesterol in Egg york by Rhodococcus equiNo.23.J Food Sci 53：659-660)。因此，在临床上，胆固醇氧化酶大量用于血浆胆固醇含量的检测。

胆固醇氧化酶作为第二代生物杀虫剂，能够有效地杀灭鞘翅目、鳞翅目、直翅目的害虫，具有良好的环境安全性(张锐，郭三堆.植物抗虫基因工程研究进展[J].生物技术通报，2001：8-12)。此外，胆固醇氧化酶在生产低胆固醇含量食品以及制备药物中间体等方面均具有良好的应用前景(Aihara H，Watanabe K，Nakamura R(1988)Degradation of cholesterol in Egg york by Rhodococcus equiNo.23.J Food Sci 53：659-660)。

但目前能真正能应用到临床上胆固醇含量检测的胆固醇氧化酶的种类单一，价格昂贵，主要原因在于产生胆固醇氧化酶的菌株产酶量低，多为胞内产酶，加大了生产成本。而作为杀虫剂的胆固醇氧化酶也仅仅来源于一种链霉菌。

发明内容：

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种胞外胆固醇氧化酶产生菌的分离方法，其特点是从自然环境、肉制品以及肉食动物新鲜粪便中分离高效胞外胆固醇氧化酶产生菌。

胞外胆固醇氧化酶产生菌的分离方法包括以下步骤：

1.采集鱼、鸡、猪、羊、牛肉制品、肉食动物新鲜粪便以及富含胆固醇的自然或人工环境土样或水样，接种在以胆固醇为唯一碳源的液体富集培养基中，于温度30-37℃振荡富集，培养3-4天；取200μl培养液至新鲜的液体分离培养基中按照上述条件，重复3次，消除样品中所含碳源的干扰；

2.取上述培养悬液200μl用无菌水稀释到10^-5、10^-6、10^-7、、10^-8、10^-9 5个浓度梯度，分别涂布于固体分离培养基上，于温度30-37℃培养3-4天，将出现的菌落接种牛肉膏蛋白胨培养基斜面上培养保存；

3.将斜面上保存的菌株活化后在3ml发酵培养基中，于温度30-37℃振荡培养48h，取发酵液，加入等体积的醋酸乙酯混匀后，静置过夜，取上层萃取液，在硅胶薄板上点样，室温下展开自然干燥后，于254nm的紫外灯下观察，硅胶薄板上出现黑色无荧光斑点者为胆固醇氧化酶催化胆固醇产生的胆甾-4-烯-3-酮，选取黑色无荧光斑点较大的菌株进行下一步筛选；

4.选取胆甾-4-烯-3-酮高产菌株进一步液体发酵培养48h，检测其发酵上清液的胆固醇氧化酶酶活性，从而筛选得到能产生胞外胆固醇氧化酶的菌株。