[发明专利]日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt－4基因的克隆、表达及应用

摘要

本发明公开了利用RACE技术从日本血吸虫19天童虫中首次扩增到一个Wnt家族基因，序列分析表明该基因的完整编码框含1311bp，编码436个氨基酸，理论分子量49.6kD。同源性分析结果表明，该基因的氨基酸序列具有典型Wnt家族蛋白特征，与日本三角涡虫、人Wnt4的氨基酸序列相似性分别达43％、37％，推测为血吸虫的Wnt4基因，命名为Sjwnt4(GenBanK登陆号DQ643829)。实时定量PCR分析显示该基因在14天童虫、19天童虫、31天成虫、44天雌虫及44天雄虫中均有表达，本发明构建了该基因的原核表达载体pGEX－4T－2－Sjwnt4，应用大肠杆菌系统进行了表达，表达蛋白以包涵体形式存在，Western印迹显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。

主权项

1.一种日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt-4基因的克隆和表达，其特征在于该方法包括下列步骤：(1)材料Trizol、GeneRacerTM Kit；Ex Taq Hot Start DNA聚合酶、限制性内切酶BamHI、Xho I、T4DNA连接酶、荧光定量PCR检测试剂盒和随机引物；羊抗鼠IgG-HRP抗GST单抗；羊抗兔IgG-HRP；逆转录酶；RNA酶抑制剂；SYBR Green I和Calibration；(2)菌种、质粒及实验动物质粒pGEX-4T-2、大肠杆菌DH5α、BL21 DE3由上海兽医研究所提供；pUCm-T载体；新西兰白兔雄性，2.5～3.0kg；日本血吸虫中国大陆株尾蚴由上海兽医研究所提供；新西兰白兔分别以腹部贴片法感染20000，5000，2000条血吸虫尾蚴，在14天、19天、31天和44天后剖杀，以肝门静脉灌注法收集虫体，液氮冻存备用；(3)方法①总RNA的提取取液氮中冻存的日本血吸虫19天童虫200mg，按Trizol试剂盒说明书进行总RNA的提取；②RACE的引物设计和扩增利用双向电泳结合肽质量指纹图谱技术获得一个Wnt家族蛋白的一段肽序列，以此肽序列为询问序列在日本血吸虫EST库中搜索到一个日本血吸虫的相应EST片断GenBankTM accession number AAM89872，长727bp，不含有完整的ORF，以该EST序列为模板设计合成RACE引物，3′RACE的两个巢式引物：3GSP1：5′-TATGCTGTGGTCGAGGATTTAAACG-3′，3GSP2：5′-GGTGTTGCAAAGTTGTCTGTAAAACA-3′；5′RACE的两个巢式引物：5GSP1：5′-GGTGTTGCAAAGTTGTCTGTAAAACA-3′，5GSP2：5′-TTGTCGTTTAAATCCTCGACCACAG-3′；具体步骤按GeneRacerTM试剂盒操作手册进行，将RACE产物克隆到试剂盒提供的pCR4-TOPO载体中，挑选阳性克隆测序，利用DNAStar软件查找3′、5′RACE产物序列与原EST序列的重叠部分，将三段序列拼接；③含ORF cDNA片断的扩增根据拼接的cDNA序列设计引物F1和F2进行含ORF cDNA片断的扩增，F1：5′-CCGGGATCCATGAATCTAACTCAGCTAGAA-3′引入酶切位点BamH I加下划线；F2：5′-CGGCTCGAGTTAATTACATGTAGATATAAC-3′引入酶切位点Xho I；取3μl在3′RACE中反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件分别为94℃预变性5min，然后94℃、30s，55℃、30s，72℃、lmin30s，共30个循环，循环结束后72℃延伸10min，PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，纯化后连pUCm-T载体，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，选单个菌落酶切鉴定，阳性质粒命名为pUCm-T-Sjwnt4并测序；④生物信息学分析将测序得到的cDNA在NCBI上进行相似性比对，利用NCBI上的ORF finder找出新基因的读码框；利用DNAstar软件对氨基酸残基数、组成、蛋白质相对分子量等参数进行分析；利用clustalW软件对不同物种Wnt蛋白进行多重比对；利用NetAcet软件进行糖基化位点预测，利用SYFPEITHI的MHCII表型在线预测工具进行T细胞表位预测；⑤荧光实时定量RT-PCR试验中选择血吸虫的持家基因α-微管蛋白为内参；分别提取14天和19天童虫、31天成虫、44天雄虫和44天雌虫总RNA，去除基因组DNA后利用随机引物合成cDNA第一链；荧光定量PCR引物：扩增Sjwnt4的引物：S1：5′-ACATACAAAATCGTCTGGTCTC-3′，S2：5′-GATGGTAAAGGCGATGTAGTC-3′，扩增片段长度214bp；扩增α-tubulin引物：T1：5′-CTGATTTTCCATTCGTTTG-3′，T2：5′-GTTGTCTACCATGAAGGCA-3′，扩增片段长度213bp；引物由上海生工合成，采用荧光染料法进行实时定量PCR，反应体系包括：5×R-PCR Buffer 5μl，250mM Mg2+ 0.3μl，10mM dNTP 0.75μl，10μM引物1.0μl，25×SYBR Green I 1.0μl，10-3×Calibration 1.0μl，5U/μl Ex Taq Hs 0.25μl，ddh2O 14.7μl，模板cDNA 1.0μl，共25μl；反应参数：95℃变性3min，95℃5s，58℃30s，40个循环，其中58℃30s结束时间点为荧光信号检测点，每个反应均做3孔重复；采用BIO-RAD公司iCyclerTM IQversion 3.0软件进行计算分析，以α-tubulin为内参标化反应结果，得出相对于每百万持家基因的目的基因含量；⑥重组表达质粒的构建从测序后确定的重组质粒pUCm-T-Sjwnt4中用限制性内切酶BamH I、Xho I切出Sjwnt4含ORF的cDNA片断，将该完整序列定向克隆于原核表达载体pGEX-4T-2的多克隆位点区，构建重组表达质粒pGEX-4T-2-Sjwnt4，并转化表达宿主菌BL21DE3；⑦在大肠杆菌中的表达将鉴定好的pGEX-4T-2-Sjwnt4/BL21DE3接种于液体LB培养基，37℃震荡培养，OD值为0.6时加终浓度为1mM的IPTG诱导表达。在IPTG诱导后0h，0.5h，1h，2h，4h，6h分别收集菌体，应用SDS-PAGE分析菌体蛋白，确定最佳诱导时间；⑧Western blotting检测将高表达时相菌体蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移到硝酸纤维素膜上，分别用抗GST单抗或经pGEX-4T-2/BL21大肠杆菌裂解液吸附处理过的日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清作一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠、羊抗兔IgG为二抗，DAB作为底物进行显色。