[发明专利]日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt－4基因的克隆、表达及应用

说明书

技术领域：

本发明属于基因技术领域，具体涉及一种日本血吸信号转导蛋白Sjwnt-4基因的克隆、表达及应用。

背景技术：

Wnts是一类从水螅、昆虫到脊椎动物中都能发现的分泌型糖蛋白，由细胞分泌出来后，与自身或邻近细胞的膜受体结合，激发下游的信号通路，调节核内靶基因的表达，决定细胞的分化命运，在动物发育中起着广泛的调节作用。Wnt蛋白异常的时空表达或异常的激活往往与肿瘤的发生有关。有研究表明，Wnt信号通路对哺乳动物生殖系统的正常发育起关键的调节作用，它主要参与了缪勒氏管及其派生器官的形成，调控卵泡的发育、排卵及黄体化，另外与正常妊娠的建立以及妊娠过程中乳腺的变化也有关。Wnt4是Wnt家族蛋白成员之一，在小鼠中，Wnt4对缪勒氏管的形成有关键意义，缺失Wnt4的雌、雄小鼠都没有缪勒氏管；Wnt4突变的雌鼠没有缪勒氏管的派生器官(即输卵管、子宫、子宫颈和阴道上部)；而沃尔夫管则继续存在。Wnt4缺失的雄性动物其睾丸的发育不受影响，但当发育着的雌性性腺中一旦缺失Wnt4信号，其结构和功能上都呈现一定的雄性化特征，性腺虽然定位在它们正确的部位，但其外形比正常的卵巢更圆，且像睾丸一样没有包被。此外，突变的性腺可以分化MIS(缪勒氏管抑制物质)及睾酮。在人类中，男性的染色体1p31～p35片断的二倍体导致了Wnt4增多，Wnt4的过量表达致使XY的男性具有了女性的表型。因此，Wnt4可能是一种性别表型的决定基因。

对血吸虫生长发育信号转导的研究是解和认识血吸虫生活特征的有效途径。但是到目前为止，对血吸虫生长发育信号转导系统的研究甚少，以致在开发高效候选疫苗分子和筛选新型药物的方面进展缓慢。而对血吸虫Wnt基因的研究国内外尚未有研究报道。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于设计血吸虫Wnt基因的有关表达。

本发明利用RACE技术首次克隆到编码日本血吸虫Wnt4蛋白的含ORF的cDNA序列，分析了该基因在日本血吸虫不同发育阶段中的表达情况，应用大肠杆菌进行了表达，并对表达产物进行了抗原性测定。

本发明提供了一种日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt-4基因的克隆和表达。

该方法包括下列步骤：

(1)材料

Trizol、GeneRacer^TM Kit购自Invitrogen公司；Ex Taq Hot Start DNA聚合酶、限制性内切酶BamHI、XhoI、T4 DNA连接酶、荧光定量PCR检测试剂盒和随机引物购自TaKaRa生物工程(大连)有限公司；羊抗鼠IgG-HRP购自天根生化科技(北京)有限公司；抗GST单抗购自SIGMA公司；羊抗兔IgG-HRP购自华美生物工程公司；逆转录酶购自Stratagen公司；RNA酶抑制剂购自Promega公司；SYBR GreenI和Calibration购自BIO-RAD公司；

(2)菌种、质粒及实验动物

质粒pGEX-4T-2、大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)由本所(上海兽医研究所)提供，pUCm-T载体购自天根生化科技(北京)有限公司。新西兰白兔(雄性，2.5～3.0kg)购自上海罗泾飞达实验动物养殖场。日本血吸虫中国大陆株尾蚴由本所(上海兽医研究所)钉螺室提供。新西兰白兔分别以腹部贴片法感染20000，5000，2000条血吸虫尾蚴，在14天、19天、31天和44天后剖杀，以肝门静脉灌注法收集虫体，液氮冻存备用；

(3)方法

①总RNA的提取取液氮中冻存的日本血吸虫19天童虫200mg，按Trizol试剂盒说明书进行总RNA的提取；