[发明专利]一种利用超声波提高农杆菌介导的苹果属植物转化效率的方法

摘要

本发明“一种利用超声波提高农杆菌介导的苹果属植物转化效率的方法”属于生物工程育种领域。将苹果属八棱海棠叶片切成小块在OD₆₀₀为0.6且含有75mg.L^－1As的农杆菌悬浮液中浸泡2分钟后，用功率为100w的超声波处理后，转移到再生培养基上进行抗性筛选，转化八棱海棠叶片，得到抗性愈伤组织和抗性苗，转化率为2.2％。本发明首次将超声波技术应用在苹果属植物的遗传转化上，大大提高了苹果属植物转基因的效率。应用超声波辅助农杆菌介导法转导rolC基因转化苹果砧木八棱海棠，分别获得了2.2％的转化效率，均大大高于普通农杆菌介导法0.1～0.8％的转化效率。

主权项

1、利用一种利用超声波提高农杆菌介导的苹果属植物转化效率的方法，其特征在于：1)将苹果属八棱海棠继代培养一个月的组织培养苗从上数第二或第三片展开叶的叶片取下，无菌条件下把叶片切成4×8mm的小块放在50ml的三角瓶中，在含有75mg.L-1乙酰丁香酮、波长为600nm的光密度OD600值为0.6、包含目的基因rolC的农杆菌悬浮液中浸泡2分钟后，用功率为100w的超声波处理30秒，再浸泡2分30秒，获得生长紧密且呈绿色的抗性愈伤组织；2)将抗性愈伤组织放到再生培养基上，22℃条件下暗培养3天后，转移到筛选培养基上继续在培养温度为22℃黑暗条件下进行抗性筛选，获得能够在卡那霉素50mg/L条件下能正常生长的抗性苗；3)通过GUS染色、PCR及Southem blotting分子检测，选择检测结果呈阳性的，即为获得整合了完整的外源rolC基因的八棱海棠株系。