[发明专利]通过信使RNA干扰酶促进活细胞内的单蛋白生成

摘要

本发明描述了活大肠杆菌细胞中的单蛋白生成(SPP)系统，其利用了mRNA干扰酶例如MazF的独特性能，MazF是一种细菌毒素，它是一种单链RNA和ACA特异性的核糖核酸内切酶，它在体内有效地和选择性地降解所有的细胞mRNA，造成了总蛋白合成的显著下降。MazF和被遗传工程改造成编码无ACA的mRNA的靶基因的伴随表达造成了持续的和高水平的(高达90％)目标表达，并基本上缺乏背景的细胞蛋白合成。值得注意的是，目标合成持续了至少4天，说明细胞尽管生长停滞但仍保留了转录和翻译的能力。SPP技术非常适用于酵母和人类蛋白，甚至是细菌的整合膜蛋白。这个新系统使得能够获得空前高的信噪比，这将显著地简化先前棘手的但生物学重要的蛋白的结构和功能研究。

主权项

1.用于在可转化的活细胞内表达单个靶蛋白同时减少非目标细胞蛋白合成的系统，包括：(a)包括具有至少一个第一mRNA干扰酶识别序列的细胞mRNA的分离的可转化的活细胞；(b)包括编码mRNA干扰酶多肽的分离的核酸序列的第一表达载体，其中通过用备选的三联密码子序列替换至少一个第二mRNA干扰酶识别序列突变了编码mRNA干扰酶多肽的分离的核酸序列，以生成编码突变的mRNA干扰酶多肽的突变的核酸序列；(c)任选地，包括编码靶蛋白的分离的核酸序列的第二表达载体，其中通过用备选的三联密码子序列替换至少一个第三mRNA干扰酶识别序列突变了编码靶蛋白的分离的核酸序列，以生成编码突变的靶蛋白的突变的核酸序列；其中用第一表达载体和第二表达载体转化分离的细胞；以及其中将分离的细胞维持在容许在所述细胞内表达突变体靶蛋白的条件下。