[发明专利]生物工程化的组织构建物、其制备方法及其应用

说明书

发明领域

本发明属于组织工程领域。本发明涉及诱导细胞体外产生细胞外基质的方法。这种有生命的细胞外基质具有类似于组织的特征，可用于检验或临床目的。

发明背景

组织工程领域将生物工程方法与生命科学的基本原理结合起来，以便了解正常及病理状态下的哺乳动物组织中结构与功能之间的关系。组织工程的目标是开发并最终应用生物代用品保存、维持或改进组织的功能。因此，通过组织工程有可能在实验室里设计并制造生物工程化的组织。生物工程化的组织可包括通常与天然哺乳动物或人类组织相关的细胞，以及合成的或外源的基质支架。新的生物工程化组织应当是移植至宿主后具有功能，而且可在该宿主体内持久掺入或由受体宿主患者的细胞不断进行生物再改造。不含支持组件或支架的组织等价体的制备为新型生物工程化组织的产生带来了科学挑战。

发明简述

本发明涉及生物工程化的组织构建物，其含有培养的细胞和无需外源性基质成分或网状系统支持物或支架组件便可内源产生的细胞外基质成分。因此，当本发明的生物工程化组织构建物是设计用于人类时，它可从人的细胞，以及由这些细胞产生的人的基质成分而完整产生。

本发明还涉及产生组织构建物的方法，其为刺激培养中的细胞，如成纤维细胞，从而在不添加任何外源性基质成分、网状系统支持物、或支架组件的情况下可产生细胞外基质成分。

本发明还涉及另一种产生组织构建物的方法，其为刺激培养中的细胞，如成纤维细胞，以便在组成已知的培养基系统中和/或在没有使用不明确或非人类衍生的生物成分，如牛血清或有机提取物的情况下产生细胞外基质成分。

该组织构建物的产生可以是，通过不同类型细胞的系列培养，导致产生与天然组织具有类似细胞组成和组织构建物的培养的组织构建物。

培养的细胞无需加入支架支持物或外源性细胞外基质成分，就可以产生所述组织构建物。

该组织构建物的强度特征使其便于操作，可以从产生它的培养仪器中轻易剥离，并在临床或检验中直接转移而无需任何支持物或载体。

本发明的组织构建物具有临床应用价值，如可移植给具有组织或器官缺陷的患者，如皮肤渍疡或伤口，或进行体外组织检验或移植入动物进行安全性检验或药物、化妆品、及化学产品的效力鉴定。

附图简述

图1图示羟脯氨酸试验中测定的相对于人类新生包皮细胞衍生的真皮构建物之细胞数的胶原浓度，如实施例1所述。

图2为显微照片(接物镜20×)，显示在化学确定型培养基中培养21天的人真皮成纤维细胞所形成的细胞-基质构建物经固定、石蜡包埋、苏木精和伊红染色后的切片。多孔膜呈现为所述构建物以下的薄层透明带。

图3为透射电镜图，显示在化学确定型培养基中培养21天的人真皮成纤维细胞所形成的细胞-基质构建物在两种分辨率下的图像。图3A为7600×分辨率，显示内源基质，包括成纤维细胞之间的胶原纤丝的排列。图3B为19000×分辨率，显示完整形成的内源胶纤丝，其证实纤丝的排列和包裹。

图4为显微照片(接物镜20×)，显示在化学确定型培养基中，在缺乏外源基质成分的情况下，形成的皮肤构建物经固定、石蜡包埋、苏木精和伊红染色后的切片，其中包含人真皮成纤维细胞在化学确定型培养基上所形成的细胞-基质构建物，以及由人的角质细胞在化学确定型培养基上形成的多层、已分化的表皮。

发明详述

现有人工活组织构建物并非完全由细胞组成，需另行加入或掺入外源基质成分或人工合成的结构和/或支持物。

本文所述经生物工程技术产生的组织构建物显示其来源组织的很多天然特征。如此产生的组织构建物可用于向患者移植或体外检测。

一个优选实施方案是一种细胞-基质构建物，其含有第一种细胞及内源产生的细胞外基质，其中所述第一种细胞能合成并分泌细胞外基质，从而产生所述细胞-基质构建物。

另一优选实施方案是一种双层构建物，其包含第一种细胞，外源产生的细胞外基质，以及由所述第一种细胞形成于其上层或其内部的一层第二种细胞。

一个更优选实施方案是一种细胞-基质构建物，其含有成纤维细胞(如衍生于真皮的那些)以形成人工培养型真皮构建物。

另一更优选实施方案是一种细胞-基质构建物，其含有成纤维细胞(如衍生于真皮的那些)以形成人工培养型真皮构建物，其上层为一层培养的角化蛋白，用于形成表皮，从而最终形成人工培养型双层皮肤构建物。本发明的人工培养型皮肤构建物可表达天然皮肤的多种物理、形态、及生化特征。