[发明专利]电化学测定核酸寡聚体杂合体的方法

说明书

                发明领域

本发明涉及一种修饰的核酸寡聚体，及一种电化学测定特定序列的核酸寡聚体杂合体的方法。

                背景技术

带有自动射线照相术或光学检测的凝胶电泳法通常用于DNA和RNA的序列分析，例如，在疾病诊断，毒理试验程序，基因研究和发展，以及在农业和药学界中。

为举例说明最著名的带有光学检测的凝胶电泳法(桑格Sanger法)，图1b表示具有引物的DNA片段。在桑格法中，含有DNA的溶液被分成四份样品，每份样品的引物用一种在特定波长发光的荧光染料进行共价修饰。例如图1b所示，向每个样品中加入脱氧核糖核苷三磷酸的碱基A(腺嘌呤)，T(胸腺嘧啶)，C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)，即dATP,dTTP,dCTP和dGTP，由引物出发，通过DNA聚合酶Ⅰ酶催复制单链。除了四个既氧核糖核苷三磷酸，每个反应混合物同样包含足够的这些核苷三磷酸中之一的2’,3’-双脱氧类似物(图1a)作为嵌段碱基(每个样品含一个属于四个可能的嵌段碱基中的一个)使在所有可能的键位上终止复制。将四个样品混合后，被复制的DNA片段的所有长度都具有嵌段碱基特有的荧光且可被凝胶电泳按照长度排序，并可用于荧光光谱定性。

另外一个光学检测方法是依据荧光染料的累积。例如，在寡核苷酸上的溴化乙锭。当这样的染料在双链DNA或RNA上累积时，其荧光与这些染料在自由的溶液中相比要增加约20倍，因此可被用于测定结合的DNA或RNA。

在放射标记中，³²P被结合在寡核苷酸的磷酸骨架中，通常³²P是通过多核苷酸激酶被加到5’-羟基的末端。此后，被标记的DNA在限定的条件下，在四种核苷酸的某一类型中的每种被优先断裂，以便得到每个链一种断裂的平均值。这样，对于一个已经给定的碱基类型，都存在于反应混合物自³²P标记到该碱基位置延伸的链中(如果碱基存在多种外观，将得到相应不同的链长)。这四种片段混合物，随后在用凝胶电泳法在四个泳道上进行分离。此后，准备凝胶自动射线照相，从中可直接读出序列。

近年来发展出了一种基于光学(或自动射线照相)检测的更进一步的DNA序列测定方法，及寡聚体杂合方法测序。(cf.例如，Drmanac et al.,Genomics4,(1989),pp.114-128，或Pains et al.,Theor.Biol.135,(1988),pp.303-307)。在这种方法中，一整套短寡核苷酸或寡聚体(探针寡核苷酸)，例如一种寡核苷酸八聚体的A,T,C，和G碱基的全部65,536种可能组合被键合到一种载体上。在含有65,536种测试位点的有序的载网上发生附着，而且每个单独的测定位点(寡核苷酸组合)的位置是已知的。在这样的一个杂合基质上，寡核苷酸碎片，一种序列待测的DNA片段，即目标DNA，用荧光染料(或³²P)标记，并在仅允许一个特定的双链形成的条件下进行杂合。在这种方法中，目标DNA片段仅附着在寡聚体上(在此例子中在八聚体上)，它们本身的序列正好被相应的一部分(一种八聚体)补足。这样，片段中的所有寡聚体序列(八聚体序列)都可以通过光学(或自动射线照相)检测杂合DNA片段的连接位置的方法测定。由于相邻的寡聚体序列的相互覆盖，可以使用适当的数学算法测定连续的DNA片段序列。这种方法的优点之一在于，测序的小型化并可在一次操作中同时捕获大量的数据。另外，可免除引物和DNA片断的凝胶电泳分离。这种原理可通过图2的有13个碱基长的DNA片段举例说明。在DNA/RNA序列测定中使用放射活性的标记也伴随着一些缺点，例如，费事，在处理放射性物质时合法地需要安全预防措施，空间上限制了分辨能力(最大1mm²)，且只有当灵敏度高时，放射活性的片段才放射作用于X-射线胶片上一适当长的时间(几小时到几天)。尽管可以通过额外的硬件和软件增加空间分辨率，且检测时间可用β-扫描器减少，但这两种方法都会增加额外的开支。