[发明专利]直接通过底物再加载进行的酶活性筛选

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外筛选目的催化剂的方法，该方法利用多重催化转换事件和直接的底物再加载。

发明背景

过去，已经以几种不同方法创建出基于新的生物聚合体(即DNA,RNA或多肽)的催化剂。下列段落描述几个这类筛选方法。

(1)．与过渡态类似物结合

利用这种方法已经分离出催化性的RNA,DNA和蛋白质(尤其是抗体)。该方法主要用于以过渡态类似物(TSA)免疫小鼠而分离催化性抗体。此外在噬菌体上展示的抗体以及RNA和DNA文库也用TSA攻击。该理念在于一种与给定的TSA结合的分子(蛋白质，RNA或DNA)可能结合底物并稳定该过渡状态的几何和/或能量特性。这可能产生催化作用。

该方法并不选择催化活性本身，但却选择与一种过渡态类似物(TSA)的结合。然而，由于它是目前分离新的催化剂最常用的方法之一所以在此处予以包括。使用该方法遇到的问题包括：ⅰ)需要了解目标反应的详细机制(以便设计一种适当的TSA)；ⅱ)许多情况下类似过渡态的TSA是难得的或不稳定的；ⅲ)不可能去模拟该反应对等物的结构和电子的动态特性。

因此，该方法只能针对极有限的反应类型。大多数情况下所分离的催化剂其转换数量不佳。

(2)．活性催化剂的功能性标记

该筛选方案已经应用于蛋白质和核酸。底物的设计使一种反应产物在反应过程中产生(该底物称为“自杀底物”或“抑制剂类似物”)。该反应产物可能与产生它的催化剂反应，形成共价键。结果，活性催化剂能够借助于所附着的标签与非活性的催化剂分离。通过这种方法已经分离出在噬菌体上展示的催化性抗体，并在一种模式系统中显示出通过这种方法能够分离催化性活性蛋白质与非活性蛋白质。该方法应该允许稀有催化剂的分离。

该方法的重要局限包括：ⅰ)许多反应不可能设计适当的自杀底物。ⅱ)在通常近几分钟的筛选过程/循环中，入选的催化剂只需表现一次转换。因此，对那些有效的催化剂没有筛选优势。

(3)．连续的演变(RNA)

RNA文库已经被设计成在同一分子中包含底物和潜在的催化域。能够进行所期望的反应(通常是连接反应)的RNAs将自己“活化”以便扩增(RNA多聚酶转录后的反转录)。通过充分稀释并加入核苷酸前体，该持续的筛选能够维持几个小时，然后进行分析。

此方法有两大局限：ⅰ)底物与催化剂都必须是核酸；ⅱ)所催化的反应与入选酶的扩增是不分离的，故该筛选步骤的时间是目标反应的转换时间和“所活化的”分子的扩增时间的总和。由于扩增是以秒计，因此，对那些有效的催化剂没有筛选优势。

(4)．底物-酶-连接的筛选(SELS)

最近，已描述了涉及目标反应的底物与对所附着的底物有潜在催化活性的蛋白质附着的方法(Pedersen等，1998，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.US)，卷95，页10523-10528；Jestin等，1999,Angew.Chem.Int.Ed.,卷38，页1124-1127；Demartis等，1999,JMB，卷286，页617-633；Neri等，1997,WO 97/40141)。在底物的分子内转换中，活性催化剂能够借助于所附着的产物被分离。

这是一种非常普通的方法。然而，因在通常近几分钟的筛选过程/循环中，入选的催化剂只需表现一次转换，因此，对有效的催化剂没有筛选优势。基于同样的原因，可以推测，那些特异活性有轻微差异的酶不可能用这种筛选方法予以区分。

发明摘要

本发明拟解决的问题是，提供一种从催化剂分子的文库中，体外筛选目的催化剂分子的方法，与所述文库中其余催化剂分子比较，该分子具有相对更有效的所需特异性催化活性，并且其中所述体外筛选方法特征在于，它允许在目的催化剂分子最后被收集以前，多次催化活性的转换(即底物到产物的催化活性的转换)。

该方法的基础在于在所述体外筛选方法中利用一种包括许多独立单位的样品并且其中所述筛选方法特征在于利用一种或多种试剂，这类试剂能够将目的催化剂分子产生的产物转换成所述目的催化剂的底物。独立单位的图示说明见图1。

相应地，本发明第一方面涉及一种从催化剂分子的文库中，体外筛选目的催化剂分子的方法，与所述文库中其余催化剂分子比较，该分子具有相对更有效的所需特异性催化活性，并且其中所述体外筛选方法特征在于，它允许在目的催化剂分子最后被收集以前，多次催化活性的转换(即底物到产物的催化活性的转换)，其中所述方法包括以下步骤，