[发明专利]在植物中降低Bowman－Birk蛋白酶抑制剂的水平

说明书

本申请要求美国临时申请No.60/097,450,1998,8月21日提交的权利。

                        发明领域

本发明涉及一种用共抑制或反义技术降低植物中Bowman-Birk蛋白酶抑制剂水平的方法。

                        发明背景

植物的种子含有贮存或称预留蛋白，这些蛋白在种子的发育过程中形成。在发芽及早期幼苗生长过程中，这些贮存物水解产生代谢中间体供生长的幼苗使用。在收获的种子中，贮存蛋白代表很重要的营养来源。通过改变贮存蛋白的组成以降低种子内不需要蛋白的量可以提高种子的营养价值。

在豆科植物种子中发现的一类主要的蛋白就是蛋白酶抑制剂，它们作为内源蛋白酶的调节因子并且保护植物免受昆虫及致病原的侵害。

植物蛋白酶抑制剂通常都是小分子量蛋白，其特点是具备和特定的动物蛋白酶偶尔也有植物蛋白酶结合的能力，因此使这些酶失去活力。研究表明有活性的蛋白酶抑制剂可能对人或其它动物有毒，给植物食品的营养价值带来负面影响，尽管在某些情况下它们是有益的。因此，有必要降低食物中的蛋白酶抑制剂的水平。

在豆科家族中蛋白酶抑制剂含量丰富，约占大豆蛋白的6％。当粗大豆饲料喂给单胃动物如鸡，大鼠和鹌鹑时，它们的抗营养本质导致脾增生，腺泡腺瘤及整体的生长减退。

大豆(Glycine max)种子蛋白是贮存蛋白的一个例子，它广泛应用于人类食物中。如婴儿食品豆腐，大豆蛋白分离物，大豆粉，纹理化的大豆纤维，以及酱油。大豆蛋白产物是人类需求中极好的价廉，高质量的蛋白来源。大豆也广泛应用于动物饲料成分。然而，这些必须进行适当加工，以去除或灭活蛋白酶抑制剂。

大豆蛋白酶抑制剂分为三类：Kunitz胰酶抑制剂(KTi)，Bowman-Birk抑制剂(BBi)，及富含甘氨酸的胰酶抑制剂(GRSTi)。这些抑制剂的氨基酸序列中含大量的含硫氨基酸(甲硫氨酸和半胱氨酸)。

KTi的主要及大量表达形式是21.5 kDa的蛋白质，它对胰酶有特定的抑制活性。BBi是一种低分子量蛋白(8000kDa)，可以在不同的位点同时抑制胰酶及胰凝乳蛋白酶。至少有10种不同的同功型BBi已被报道。GRSTi是大豆种子中胰酶的次要抑制剂。

为了提高粮食的营养价值，采取了各种方法以降低大豆中蛋白酶抑制剂的含量及活性。这些包括物理的(热)和化学的方法对大豆产品进行处理，还包括通过常规育种技术对大豆进行遗传改造。

在任何热处理中必须小心，因为即使是需要热来破坏胰酶抑制剂，不适当的加热也会降低大豆蛋白本身的营养价值。进一步而言，尽管通过常规应用的热处理对大豆粉处理后可以通过变性使蛋白酶抑制剂大量失活，但仍有10-15％的残留活性。BBi的异常结构是导致残留活性的最可能的原因。BBi通过二硫键紧密交联在一起，使得单独的分子对热有很强的抗性。这样对种子或大豆制品进行热处理以降低抑制剂的表达是不完全成功的，而且从能量上讲是昂贵的，而且，大豆粗蛋白制品通常含有原大豆5％-20％的活性，(Rackis,J.J；Gumbmann,M.R.in Antinutrients and natrual toxicants in food；Ory,R.L；ED.；Food and Nutrition Press；Westport,CT,1981,P203)因此存在一点顾虑，由于这些未变性的BBi导致的残留活性可能是一种严重的健康问题(Liener,I.E.(1986)J.Nutr.166:920-923)。

另一种从原大豆中去除蛋白酶抑制剂的方法是溶剂抽提法。这种化学抽提方法在去掉各种各样抑制物质的同时也导致了种子中相当数量的油脂的丧失，这样，降低了它的食物价值。同时，还存在清除及处置溶剂的问题。

对大豆植株进行遗传改造以发展低抑制剂活性的品种这种思路也已被提出。然而这种思路有许多缺陷。在失去抑制剂的同时，相当数量的营养价时也丢失了。遗传变种与另一个品种之间的交叉授粉会导致蛋白酶抑制剂基因的重新表达。进一步而言，改变一个抑制剂的表达并不会影响另一个的表达。至今常规育种技术和组织培养技术不能产生一个低水平蛋白酶抑制剂的植株，尽管存在对这种植株的需要。