[发明专利]改进的生产类鞘氨醇碱的微生物菌株

说明书

发明领域

本发明涉及其类鞘氨醇碱(sphingoid base)生产力提高的微生物菌株和其制备方法。

发明背景

术语“鞘脂类”指一组从类鞘氨醇碱衍生的脂质象鞘氨醇。鞘脂类常常存在于动物，植物和微生物的细胞膜中。人中鞘脂类的确切功能还不得而知，但是在神经系统中的电信号传递中以及在细胞膜的稳定化作用中涉及这一组化合物这一点是清楚的。还曾经提出糖鞘氨醇在免疫系统中具有功能：作为细菌毒素的受体，还有可能作为细菌和病毒的受体的特异性糖鞘氨醇功能。

神经酰胺是一组特殊的鞘脂类，包含作为与脂肪酸键连的酰胺键中的碱的鞘氨醇，二氢鞘氨醇或植物鞘氨醇。神经酰胺是皮肤上层角质层的主要脂质成分。角质层具有重要的屏障功能，外部的化合物一般被其屏障阻挡在外并且限制水分的减少。局部施用含有例如神经酰胺这样的鞘脂类的组合物改进了例如皮肤的屏障功能和保持水分的性质(Curatolo,1987，药物研究(Pharm.Res.)4,271-177；Kerscher等，1991，欧洲皮肤病学杂志(Eur.J.Dermatol.)1.39-43)。

已知这样的类鞘氨醇碱通过抑制蛋白激酶C的活性而介导几种生理学作用，所述蛋白激酶C是信号传导途径中关键的酶。此外，因为其抗炎和抗微生物活性，在化妆品或皮肤病学组合物中含有类鞘氨醇碱。

近来，用于化妆品的异源鞘脂制剂主要从动物来源提取。明显地，这在工业规模上是花费相当大的方法。此外，发现这些材料具有潜在的不安全性，例如由于在牛组织中可能存在牛海绵状脑病(BSE)。因此，化妆品工业证明从除动物组织之外的来源获得纯的完全确定的鞘脂类新的来源越来越引起人们的兴趣。

已经发现例如酵母Pichia ciferrii(Wickerham和Stodola,1960，细菌学杂志(J.Bacteriol.)80,484-491)的微生物生产鞘脂类，例如鞘氨醇，植物鞘氨醇和/或它们的衍生物。该发现提供了鞘脂类本身和其用作制备其他商业有价值的化合物的起始物的来源，提供了对这些化合物的动物来源的应用的可行的另一种选择。

例如，Pichia ciferrii生产的鞘氨醇，二氢鞘氨醇和植物鞘氨醇的乙酰化衍生物可以去乙酰化，并且这样获得鞘氨醇，二氢鞘氨醇或植物鞘氨醇可以化学转化为相关的化合物，例如神经酰胺，假神经酰胺和/或糖神经酰胺，它们接着可以在化妆品和皮肤病学产品中使用(国际专利申请WO93/20038)。

令人遗憾的是，迄今为止所研究的菌株中，甚至包括Pichiaciferrii NRRL Y-1031 F-60-10，没有一种生产足够量的鞘脂类碱，例如鞘氨醇，植物鞘氨醇或者它们的衍生物，成为这样的化合物的有效的经济上吸引人的来源。

国际专利申请WO95/12683公开了Pichia ciferrii菌株，其与亲本菌株NRRL Y-1031 F-60-10相比具有增大的TAPS生产力。但是，这些“改进的”菌株的生产力被提高到至多1.6倍。尽管强烈期望获得具有高得多的生产力的菌株，但是由于类鞘氨醇碱对微生物细胞的毒性还不能确定是否能实现生产力的进一步改进(Pinto等，1992,J.Bacteriol.174,2565-2574；Bibel等，1992，皮肤病研究杂志(J.Invest.Dermatol.)98.269-273)。

发明的描述

本发明公开了具有大大提高的类鞘氨醇碱或者其衍生物的生产力的毕赤酵母属菌株。在本发明说明书中，大大提高的类鞘氨醇碱或者其衍生物的生产力指当在相同的条件下测定时，是保藏为CBS408.94的(参见WO95/12683)Pichia ciferrii Y-1031 F-60-10的生产力的至少2倍的生产力。优选地，大大提高的类鞘氨醇碱或者其衍生物的生产力指是保藏为CBS408.94的Pichia ciferrii Y-1031 F-60-10的生产力的至少4倍，更优选至少6倍，更优选至少8倍，最优选至少10倍的生产力。

本发明进一步公开了分离具有提高的类鞘氨醇碱或者其衍生物的生产力的微生物菌株的新的方法。

本发明的新的方法包括最初的筛选步骤，其中通过测定所述菌株系列中存在的各菌株生产的类鞘氨醇碱或者其衍生物的抗微生物活性来测定一系列菌株的类鞘氨醇碱生产力。该最初的筛选步骤有利地对大量各菌株筛选它们的类鞘氨醇碱生产力，并且选择一小组与参照菌株相比具有提高的生产力的在菌株中富集的菌株。