[发明专利]借助于环形层析法分离和/或离析血浆蛋白的方法

说明书

本发明是关于一种从含有血浆蛋白的混合物中分离和/或离析血浆蛋白的方法。

血浆蛋白在许多生理过程中发挥重要的作用。因此，例如，在血液凝固的级联过程中，维生素K依赖性血浆糖蛋白具有突出的作用。

因此，回收血浆蛋白是一种重要的技术性方法。用于制备血浆蛋白的起始材料已经是比较贵重，因为它是从例如捐献的血液获得。无论从经济的还是从伦理道德的原因，提供以高回收率产生所需要的具有高活性血浆蛋白的方法都是重要的。当前除了重组备制法之外，通常还是通过应用常规的层析法从血浆中获得血浆蛋白。

已经发现，借助于环形层析法可以在一个数量级的范围内分离和离析大分子量物质。还进一步发现，甚至可以从复杂的混合物中以惊人简便的方法获得纯化形式的人血浆蛋白。通过包括如下步骤的方法可达到此目的：将含有血浆蛋白，特别是人血浆蛋白的混合物施加于具有环形结构的分离介质。使此具有环形结构的分离介质环绕一个轴垂直地旋转，此轴已被限定在混合物通过具有环形结构的分离介质流动的方向。使洗脱液通过具有环形结构的分离介质，收集在具有环形结构的分离介质末端流出的组份。

在K.Reissner等，层析杂志A,763(1992)49-56中已描述了应用环形层析法对含有牛血清白蛋白的混合物体脱盐处理。Reissner等认为，待分离物，即牛血清白蛋白和小分子量盐之间大小的巨大差异，对层析纯化的成功是决定性的。Bloomingburg等(英国化学研究索引30,1061-1067(1991))已指出，借助于具有环形结构的阳离子交换剂可以分离纯化成分牛血清白蛋白和牛血红蛋白的混合物。可以在无梯度条件下用单一洗脱剂进行洗脱。多种施加方法可用于施加样品材料。

为了实施本发明的方法，优选地是使用本文中描述的装置。图1图解显示出这种装置。图2显示出因子Ⅷ和Von Willebrand因子复合物典型层析谱，而图3显示因子Ⅸ的相应层析谱。图4显示对BSA和IgG的分离。图5显示通过柱层析的传统分离结果。

优选地用含有病毒灭活血浆蛋白的血浆或混合物作为待分离和/或待离析血浆糖蛋白的来源。可借助于例如通常的方法对这种含有血浆蛋白的混合物进行预先处理。特别是为了病毒灭活，可采用一些已知为溶剂/去污剂法的方法。例如，特别在B.Horowitz等，“血液”79(1992),826-831中描述了这样一种方法。

因此，这种混合物可能还含有去污剂，而且这种去污剂还可能抑制不希望存在的血浆蛋白与分离介质的非特异性相互作用。所采用的混合物不仅可以从血浆获得，而且还可能作为已通过基因工程制备的，含有人血浆蛋白的细胞培养物组份被提供。

具有环形结构的分离介质优选地由用于吸附层析的材料组成，例如用于离子交换层析、凝胶渗透层析，分子大小排阻层析或亲和层析，或者基于疏水性相互作用层析的材料。采用的是常用材料。

在一种层析构型中使用一种以上分离介质也可能是优选的。因此，可用不同的分离介质层包裹层析柱，以便达到联合分离的作用。不但可以选用相似的介质，而且还可以选用完全不同的介质，例如一种阴离子交换剂和一种用于疏水性相互作用层析的介质，或者二种不同强度的阴离子交换剂，或者一种吸附材料和一种用于凝胶渗透层析的材料。但是应该小心，不要使这些材料发生不希望有的混合，并且所用的缓冲液应适合于所有被采用的分离材料。

优选的分离介质是作为一个紧密的整块材料(整体料)被采用，并且，此材料已经具有适合于例如分离柱的圆环形。可以使这种介质与例如一种疏松包裹的层析材料组合。适合作为分离介质的整块成形的介质不仅是通过嵌段聚合作用得到的无机或有机整体料，例如在EP-A-0320023中公开的，该申请在此被引入作为参考。支持材料如成形的膜或者具有织物结构的膜，例如以纤维素为基础的膜，也可以被用于环形层析。可任选地对这种整体材料或支持材料进行表面修饰，以便获得可能需要的配体。

另一个有利的实施方案关系到对分离介质适当地施加样品材料。已发现，优选地应该使用为了良好地引导局部施加样品材料的施加介质。可以使用任何一种足以立即使样品局部化，并且不与分离介质混合的材料。这可以通过对材料的特殊选择来保证，其中选择材料的密度和表面状态起重要的作用。但是，也可能使用一种在施加介质和分离介质之间提供一个分隔层的装置。优选地可使用球形微粒，例如玻璃微珠作为施加介质，可任选地处理这种微粒，以便防止非特异性相互作用。