[发明专利]花粉特异性启动子

说明书

本发明涉及花粉特异性启动子序列，含有该启动子的构建体和转基因植物细胞及植物，转化花粉的方法以及使用该启动子控制植物能育性的方法。

为了将两种植物的所需遗传性状导入一种植物，如品种或杂种，传统的方法是杂交繁育。为了可靠地获得性状一致的杂种，必需确保亲本植物不会自花传粉。

通过确保亲本系之一为雄性不育可以做到这一点。产生雄性不育的多种技术是已知的，也是本领域推荐使用的。其中一种方法包括人工地或机械化地除去雌性亲本植物的花药或穗状雄花。该植物只有通过雄性亲本的花粉才具有能育性，因此其后代为杂种。然而，该方法费力而且不完全可靠，因为一些雌性植物可能未被除去穗状雄花，或者在某些情况下，植物在被除去穗状雄花之后还会长出第二个穗状雄花。另外，在此系统中，雄性亲本能自花传粉，因此必需物理分离雄性和雌性亲本，从而使杂种的收获变得容易。这种分段种植法对于玉米很适用，因为其花粉较轻且量大。然而，该方法并不适用于花粉较重的种以及雄性和雌性花器包含在同一朵花中的种，如小麦，水稻。

防止花粉产生的化学方法也是已知的，美国专利4,801,326描述了可应用于植物或土壤以防止花粉产生的化合物。然而，这种技术也是费力的，而且不是十分可靠。必需以适当的时间间隔施用足够的化合物以确保传粉不会发生，这会对环境造成污染。另外，这些化合物还很昂贵。

基因工程提供了另一种替代方法，籍此在植物中产生，维持和/或随后恢复雄性不育。

已描述了一些系统，其中可诱导的启动子可根据外部化合物的施用或有效性来启动或关闭能育性。例如，WO 90/08830描述了通过表达破坏花粉生物合成的蛋白质的基因序列级联系统诱导植物雄性不育。WO 93/18171描述了使用GST启动子诱导型表达查耳酮合酶(chs)，并恢复了通过“敲除”内源性chs基因而具有不育性状的雄性不育植物的能育性。

WO 93/25695(PGS)中描述了不同的方法，该方法依靠使用绒毡层特异性启动子在绒毡层细胞中表达花粉致死基因芽孢杆菌RNA酶，该酶对花粉的产生是至关重要的，因此可破坏花粉产生。可使用恢复基因芽孢杆菌RNA酶抑制剂来恢复能育性(Mariani等，自然，Vol357:384-387)。

直接以可控制的方式在花粉中表达对花粉产生有影响的基因将是有利的。必要时，能育性应能被恢复。

基因工程雄性不育系统的组成成分是使用在花粉中或花粉产生或发育所依赖的组织中特异性地驱动表达的启动子。

很多在花粉和萌发的花粉中特异性表达或高表达的特征性基因编码对细胞壁代谢可能起作用的蛋白质，例如，与编码参与果胶降解的酶；多聚半乳糖醛酸酶(SM Brown等..，植物细胞(1990)2:263-274,SJ Tebbutt等..，植物分子生物学。(1994)25:283-299)，果胶酸裂解酶(HJ Rogers等.，植物分子生物学，20:493-502(1992),RAWing等.，植物分子生物学，14:17-28(1989))和果胶甲基酯酶(PME)(JH Mu等.，植物分子生物学，25:539-544(1994))的基因具有同源性的基因。

其它在花粉中高表达的基因包括编码细胞骨架蛋白(I.Lopez等..，Proc.Natl,Acad Sci USA 93:7415-7420(1996),HJ Rogers等..，植物杂志4:875-882(1993)和CJ Staiger等..，植物杂志4；631-641(1993))，推定的抗坏血酸氧化酶，Kunitz蛋白抑制剂的基因和很多其功能不能由与已知基因的同源性推断的其它基因。已研究了这些基因的时序表达，发现在成熟的小孢子母细胞中，很多基因在小孢子发生的晚期表达量最高。在某些情况下，阐明了花粉管中的持续表达(AK Kononowicz等.，植物细胞4；513-524(1992))。这些基因被称为“晚期基因”。此阶段的大多数表达来自营养细胞而不是生殖细胞，大多数晚期基因可能由营养核转录而来；但仅证实了一个“晚期”基因是由营养核转录得到的(D.Twell，植物杂志2:887-892(1992)。已发现花药中表达的不同类别的基因具有不同的表达程序，四分体阶段后不久即可首次检测到表达，而在花粉成熟之前表达量已直线减少。这些“早期”基因的主要作用可能在小孢子分化和发育而不是花粉管生长的过程中体现。另外，美国专利5.086,169(Mascarenhas)描述了从玉米中分离出的第一个花粉特异性启动子。

发明人已分离出另一个仅在花粉组织中特异性表达的启动子。该启动子得自分离自玉米的“晚期”花粉表达基因ZmC5。