[发明专利]以成年体细胞胞核重建的去核卵母细胞足月发育成动物

权利要求书

1．一种克隆动物的方法，该方法包括下列步骤：

(a)从成年动物的体细胞收集体细胞胞核；

(b)将包括染色体的至少一部分体细胞胞核插入去核卵母细胞中形成核植入的卵母细胞；

(c)使核植入的卵母细胞发育成胚胎；和

(d)使胚胎发育成活的后代。

2．根据权利要求1所述的方法，其中成年体细胞是卵丘细胞。

3．根据权利要求1所述的方法，其中成年体细胞是成纤维细胞。

4．根据权利要求3所述的方法，其中成纤维细胞是培养的细胞。

5．根据权利要求3所述的方法，其中成纤维细胞来自成年雄性动物。

6．根据权利要求3所述的方法，其中成纤维细胞来自成年雌性动物。

7．根据权利要求1所述的方法，其中成年体细胞胞核具有二倍染色体。

8．根据权利要求1所述的方法，其中成年体细胞胞核是2C至4C。

9．根据权利要求1所述的方法，其中将成年体细胞胞核插入去核卵母细胞的细胞质中。

10．根据权利要求1所述的方法，其中插入步骤通过显微注射来实现。

11．根据权利要求10所述的方法，其中显微注射是压电驱动的显微注射。

12．根据权利要求1所述的方法，其中去核卵母细胞停滞于第二次减数分裂的中期。

13．根据权利要求1所述的方法，它还包括在插入成年体细胞胞核之前、同时或之后激活卵母细胞的步骤。

14．根据权利要求13所述的方法，其中激活步骤发生在插入成年体细胞胞核后0至6小时内。

15．根据权利要求13所述的方法，其中激活步骤发生在插入成年体细胞胞核之后1至3小时内。

16．根据权利要求13所述的方法，其中激活步骤包括电激活、或暴露于化学激活剂。

17．根据权利要求16所述的方法，其中化学激活剂选自乙醇、精子胞质因子、卵母细胞受体配体肽模拟物、Ca²⁺释放的药物刺激剂、Ca²⁺离子载体、锶离子、磷蛋白信号传导调节剂、蛋白合成的抑制剂和它们的组合。

18．根据权利要求16所述的方法，其中化学激活剂选自咖啡碱、Ca²⁺离子载体A23187、乙醇、2-氨基嘌呤、星形孢菌素、鞘氨醇、环己酰胺、离子霉素、6-二甲基氨基嘌呤和它们的组合。

19．根据权利要求17所述的方法，其中激活剂包括Sr²⁺。

20．根据权利要求1所述的方法，该方法还包括在插入成年体细胞胞核之前或之后破坏卵母细胞中的微管和/或微丝装配一段时间的步骤。

21．根据权利要求20所述的方法，其中该时间间隔为0至6小时。

22．根据权利要求20所述的方法，其中用选自细胞松弛素B、噻氨酯哒唑、秋水仙碱及其组合的物质破坏微管和/或微丝装配。

23．根据权利要求22所述的方法，其中用细胞松弛素B破坏微管和/或微丝装配。

24．根据权利要求1所述的方法，该方法还包括在插入成年体细胞胞核之前或之后破坏卵母细胞中的微丝一段时间的步骤。

25．根据权利要求24所述的方法，其中该时间间隔为0至6小时。

26．根据权利要求24所述的方法，其中用细胞松弛素D、甲斯普拉诺、拉纯库林A或它们的组合来破坏微丝。

27．根据权利要求1所述的方法，其中使胚胎发育成活后代的步骤还包括将胚胎转移给雌性替代接受者的分步骤，其中该胚胎发育成活的胎儿。

28．根据权利要求1所述的方法，其中插入步骤还包括将试剂加入所述卵母细胞的细胞质中。

29．根据权利要求28所述的方法，其中该试剂选自外源蛋白、外源蛋白的衍生物、抗体、药物制剂及其组合。