[发明专利]大量生产抗微生物肽的方法及其DNA构建体及表达系统

说明书

技术领域及现有技术

本发明涉及重组DNA技术。本发明还涉及从微生物中大量生产抗微生物物质及DNA构建体及载体系统。由于抗微生物肽呈现活性的机制完全不同于能产生抗性等严重问题的常规抗生素，生物活性肽(后文称抗微生物肽)很少会表现出抗性。因而此抗微生物肽在制药及食品工业领域具有高工业实用性。

但工业用抗微生物肽的主要障碍是难以廉价地大量生产抗微生物肽。例如，通过化学合成生产抗微生物肽就不廉价。同样，人们尝试通过微生物经遗传工程生产抗微生物肽，但在此情况下，抗微生物肽的表达水平非常低。

美国专利5,206,154提供了一DNA构建体，其包括一能抑制杀菌肽的杀菌功能的多肽基因，及与该多肽基因融合的杀菌肽基因。该专利中揭示的多肽例如是araB基因。

美国专利5,593,866提供了一种阳离子抗微生物肽的微生物生产方法，其中阳离子肽与一种阴离子肽融合被表达，以免于被细菌蛋白酶水解。

发明揭示

本发明提供了一种DNA构建体以大量生产抗微生物肽。本发明还提供了一种能从微生物中有效生产并回收抗微生物肽的DNA构建体。

另外，本发明还提供了能提高所需肽的表达、分离及纯化功效的基因多聚体及此构建体的构建方法。

本发明还进一步提供一表达载体以从微生物中大量生产抗微生物肽。

本发明还提供一从微生物中大量生产抗微生物肽的方法。

附图简要描述

图1是编码本发明抗微生物肽的核苷酸序列。

图2是编码融合配偶体的核苷酸序列。

图3是在融合配偶体与MSI-344基因间通过产生编码产生CNBr切割位点的序列的融合方法图式。

图4是在融合配偶体与MSI-344基因间通过产生编码产生羟胺切割位点的序列的融合方法图式。

图5是转录融合多聚体的构建图式。

图6是pGNX2载体的构建图式。

图7是pT7K2.1载体的构建图式。

图8是pGNX3载体的构建图式。

图9是pGNX4载体。

图10是pGNX5载体的构建图式。

图11是通过乳糖或IPTG诱导的表达MSI-344的转化子的裂解物的SDS-PAGE电泳分析。

图12是用各种载体表达的MSI-344的SDS-PAGE电泳分析。

图13a是通过乳糖诱导的表达各种抗微生物肽的转化子的裂解物的SDS-PAGE电泳分析。

图13b是通过乳糖诱导的表达各种抗微生物肽的转化子的裂解物的SDS-PAGE电泳分析。

图14a，14b，14c及14d是通过乳糖诱导的表达各种抗微生物肽的转化子的裂解物的SDS-PAGE电泳分析。

图15是表达融合基因单体，二聚体及四聚体的转化子的裂解物的SDS-PAGE电泳分析。

发明详述

本发明涉及有效地在E.coli或其它原核生物内大量生产抗微生物肽的DNA构建体。

从微生物中大量生产抗微生物肽的必需条件之一是有效地中和抗微生物肽对微生物的毒性。为此本发明提供了一DNA构建体，其中purF基因(谷氨酰胺焦磷酸核糖基焦磷酸酰胺转移酶；Genbank：X12423)(Tso et al，J.Biol.Chem.，257：3525，1982，Makaroff et al，J.Bio.Chem.，258：10586，1983>的全部、部分或衍生物作为融合配偶体与编码抗微生物肽的基因融合。

用作本发明的DNA构建体中的融合配偶体的purF基因的衍生物使得能在E.coli中以与purF衍生物融合的多肽形式大量生产抗微生物肽，同时不杀伤宿主细胞。由于它们不致死宿主细胞，因而应用强表达系统从宿主微生物中大量生产所需抗微生物肽是可能的。在应用如本发明融合配偶体表达肽的情况中，通过应用蛋白酶或其它化合物，可从融合蛋白中切割及分离抗微生物肽。为达到此目的，例如可将一种DNA序列插入融合配偶体与抗微生物肽基因之间，所述DNA序列编码蛋白酶如因子Xa，或肠激酶或如CNBr或羟胺的化合物的切割位点。

例如，为提供CNBr切割位点，可将含Met密码子(ATG)具有正确读框的限制性酶位点如Afl III，Bsm I，BspH I，BspLU11 I，Nco I，Nde I，Nsi I，Ppu10 I，Sph I，Sty I或其同裂酶插入融合配偶体的3′末端。通过将限制性酶位点插入编码抗微生物肽的基因的5′末端从而产生融合配偶体酶位点的匹配末端，可产生融合配偶体与编码抗微生物肽的基因的框内融合体。