[发明专利]利用辅助肽制造肽的方法

权利要求书

1.具有生物学活性的肽的制造方法，该方法包括如下工序：

工序(1)：利用含有编码附加了辅助肽的目的肽或编码在附加了辅助肽的目的肽基础上又进一步附加了保护肽的融合蛋白的碱基序列的表达载体转化细胞，然后培养该转化细胞，从该培养物中收集附加了上述辅助肽的目的肽或上述融合蛋白的工序；

工序(2)：当从工序(1)中得到融合蛋白时，从该融合蛋白中裂解分离附加了辅助肽的目的肽与保护肽，按照要求进一步进行纯化的工序；

工序(3)：在有必要对目的肽进行修饰时，对工序(1)或工序(2)得到的附加了辅助肽的目的肽实施修饰反应的工序；

工序(4)：从工序(1)、工序(2)或工序(3)得到的附加了辅助肽的目的肽中裂解分离辅助肽与目的肽，按照需要进一步进行纯化的工序，以及

工序(5)：对在工序(4)中得到的目的肽进行纯化的工序。

2.权利要求1记载的制造方法，其特征是：上述辅助肽含有5～50个氨基酸残基。

3.权利要求1至2记载的制造方法，其特征是：附加了上述辅助肽的目的肽的等电点为8～12。

4.权利要求1至3中任一项记载的制造方法，其特征是：上述目的肽含有200个以下的氨基酸残基。

5.权利要求1至4中任一项记载的制造方法，其特征是：上述保护肽含有30～200个氨基酸残基。

6.权利要求1至5中任一项记载的制造方法，其特征是：在纯化工序中使用了离子交换树脂。

7.权利要求6记载的制造方法，其特征是：离子交换树脂是阳离子交换树脂。

8.权利要求1至5中任一项记载的制造方法，其特征是：在纯化工序中使用了反相或疏水性层析。

9.权利要求1至8中任一项记载的制造方法，其特征是：为了维持目的肽的溶解性，在工序(1)～(5)中至少有一个工序添加了表面活性剂和/或盐。

10.权利要求1至9中任一项记载的制造方法，其特征是：宿主细胞是原核细胞或真核细胞。

11.权利要求10记载的制造方法，其特征是：宿主细胞是大肠杆菌。

12.权利要求1至11中任一项记载的制造方法，其特征是：附加了辅助肽的目的肽的等电点为8～12。

13.权利要求1至11中任一项记载的制造方法，其特征是：目的肽是酰胺化肽。

14.权利要求1至11中任一项记载的制造方法，其特征是：目的肽是具有促胰岛素释放活性的GLP-1衍生物。

15.权利要求14记载的制造方法，其特征是：附加了辅助肽的具有促胰岛素释放活性的GLP-1衍生物的等电点为8～12。

16.权利要求14至15记载的制造方法，其特征是：具有促胰岛素释放活性的GLP-1衍生物的等电点为4.5～9.0。

17.权利要求14至15记载的制造方法，其特征是：具有促胰岛素释放活性的GLP-1衍生物的等电点为5.5～7.5。

18.权利要求12至17中任一项记载的制造方法，其特征是：在纯化工序中使用了离子交换树脂。

19.权利要求18记载的制造方法，其特征是：离子交换树脂是阳离子交换树脂。

20.权利要求12至17中任一项记载的制造方法，其特征是：在纯化工序中使用了反相或疏水性层析。

21.权利要求12至17中任一项记载的制造方法，其特征是：为了维持目的肽的溶解性，添加了表面活性剂和/或盐。

22.权利要求14至21中任一项记载的制造方法，其特征是：得到的具有促胰岛素释放活性的GLP-1衍生物的纯度在98％以上。

23.权利要求1至22中任一项记载的制造方法，其特征是：在最终纯化物中内毒素的含量在0.03unit/mg以下。

24.糖尿病治疗用医药组合物，是以通过权利要求14至23中任一项记载的制造方法得到的具有促胰岛素释放活性的GLP-1衍生物作为有效成分的。