[发明专利]生产L－氨基酸的方法

说明书

本发明涉及生产氨基酸的方法。具体而言，本发明涉及属于埃希氏菌属的产L-氨基酸细菌和使用该细菌生产L-氨基酸的方法，更具体而言是生产L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的方法。

为了通过发酵生产L-氨基酸，使用了分离自自然界的菌株或该菌株的人工突变体来提高产量。例如，在生产L-赖氨酸时，已知有多种产L-赖氨酸的人工突变体，其中大多数是S-2-氨乙基半胱氨酸(AEC)抗性突变体，属于短杆菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属或埃希氏菌属。而且，已提出了一些增加氨基酸产量的途径，如使用通过重组DNA法获得的转化体(美国专利4,278,765)。

这些途径多数基于提高参与氨基酸生物合成途径的酶的活性，使该酶转变成对抑制不敏感等(关于埃希氏菌属细菌，参见日本专利申请公开号56-18596(1981)和国际公开WO95/16042)。

另一方面，作为通过增加氨基酸分泌蛋白而提高氨基酸产率的例子，已知有一种属于棒杆菌属的细菌，其中L-赖氨酸分泌蛋白基因LysE被增加。然而，对于属于埃希氏菌的细菌，甚至还不知道是否存在L-氨基酸分泌蛋白。因此，使用埃希氏菌属细菌时，不知道增加L-氨基酸分泌蛋白对L-氨基酸生产是否有效。

尽管属于埃希氏菌属的大肠杆菌K-12菌株的全部核苷酸序列已经确定(Science，277，1453-1474，1997)，但其中有大量蛋白的功能还不知道。

本发明的目的是获得参与L-氨基酸分泌的蛋白，从而提供L-氨基酸产率提高的菌株和通过发酵生产L-氨基酸的改良方法。

发明人已对参与L-氨基酸分泌的蛋白进行了筛选。结果，发明人发现当增强一种特定基因时，基于消耗的糖的L-氨基酸产量增加了。基于这一发现完成了本发明。

因此，本发明提供了具有产生L-氨基酸能力的埃希氏菌属细菌，其中产L-氨基酸的能力通过增加至少一种选自以下(A)到(H)的蛋白的表达量而得到提高(以下称为“本发明的细菌”)：

(A)具有序列表中SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的蛋白；

(B)具有在序列表中SEQ ID NO：10所示氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、置换、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白，该蛋白具有增加含该蛋白的细菌产生L-氨基酸的能力的活性；

(C)具有序列表中SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的蛋白；

(D)具有在序列表中SEQ ID NO：12所示氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、置换、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白，该蛋白具有增加含该蛋白的细菌产生L-氨基酸的能力的活性；

(E)具有序列表中SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的蛋白；

(F)具有在序列表中SEQ ID NO：14所示氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、置换、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白，该蛋白具有增加含该蛋白的细菌产生L-氨基酸的能力的活性；

(G)具有序列表中SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的蛋白；或

(H)具有在序列表中SEQ ID NO：16所示氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、置换、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白，该蛋白具有增加含该蛋白的细菌产生L-氨基酸的能力的活性。

本发明的细菌优选一种产L-赖氨酸细菌，其中选自(A)到(D)，(G)和(H)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-谷氨酸细菌，其中选自(A)到(H)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-丙氨酸细菌，其中选自(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-缬氨酸细菌，其中选自(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-组氨酸细菌，其中选自(C)到(F)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-脯氨酸细菌，其中选自(A)到(F)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-苏氨酸细菌，其中选自(E)和(F)的至少一种蛋白的表达量增加；一种产L-精氨酸细菌，其中选自(G)和(H)的至少一种蛋白的表达量增加；或一种产L-异亮氨酸细菌，其中选自(C)和(D)的至少一种蛋白的表达量增加。

优选，本发明的细菌中编码细胞中所述蛋白的DNA的拷贝数量增加。该DNA优选携带于细胞中的多拷贝质粒或转座子上。

本发明还提供了生产L-氨基酸的方法，包括以下步骤：

在培养基中培养本发明的细菌，在培养基中产生和积累L-氨基酸；

由培养基中回收L-氨基酸(以下也称为“本发明的细菌”)。