[发明专利]细胞因子或生长因子模拟物聚合物的设计及其应用

说明书

本发明属生物工程技术领域。

许多细胞因子或生长因子如红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、生长激素(GH)、催乳激素(PRL)、粒性白细胞集落生长因子(G-CSF)、干细胞生长因子(SCF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)等都是通过与受体结合，导致细胞表面的受体形成二聚体从而引发信号传递，发挥其生物学功能。近年来凭籍组合化学和噬菌体表面显示肽库技术的发展和成熟，科学家们已筛选获得肿瘤坏死因子模拟物、红细胞生成素模拟物、血小板生成素模拟物、生长激素模拟物等，但这些模拟物的生物活性都比原来的细胞因子或生长因子活性低。为了提高模拟物的生物活性，科学家们尝试通过β-丙氨酸-(α-氨基)-赖氨酸-(ε-氨基)-两肽作为连接肽，以β-丙氨酸的氨基和赖氨酸的ε-氨基和两个EPO模拟肽或TPO模拟肽分子的C端相连接，从而合成了EPO模拟肽或TPO模拟肽双体分子，模拟肽双体分子的生物活性较模拟肽单体分子的生物活性有显著的提高(Wrighton,N.C.等Nature Biotechnology15,1261-1265,1997；Cwirla,S.E.等Science276,1696-1699,1997)。

为了突破现有方法的局限，开辟一条提高细胞因子或生长因子模拟物的生物活性的创新思路，本发明的目的是设计、研制一种新型结构形式的细胞因子或生长因子模拟物；该种新的模拟物结构形式能显著、有效地改善和提高细胞因子或生长因子模拟物的生物活性；该种新的模拟物结构形式的设计思路是通过极大地强化受体二聚体的形成，以增强其生物活性。

本发明的目的可以通过以下措施来达到：

合成或构建细胞因子或生长因子模拟物四聚体。对于通过与受体结合，导致细胞表面的受体形成二聚体从而引发信号传递，发挥其生物学功能的细胞因子或生长因子，该种细胞因子或生长因子模拟物四聚体的作用是极大地强化受体二聚体的形成，从而增强其生物活性。本发明中的细胞因子或生长因子模拟物四聚体是指细胞因子或生长因子的模拟肽或者化学模拟物、及其衍生物的四聚体结构形式。该四聚体结构系指由共价键或离子键等方法连接而成的四聚体结构形式。对于细胞因子或生长因子模拟肽，其方法可以是：连续合成一个模拟肽二聚体，在该二聚体中：二个模拟肽单体之间有一个半胱氨酸；将模拟肽二聚体进行氧化，形成以二硫键相连的两个模拟肽二聚体物，即呈“X”或“H”形状的模拟肽四聚体结构形式。本发明所述模拟肽四聚体结构形式的合成、生产方法常规、简单；其生物活性明显优于模拟肽二聚体结构形式，对设计、研制、生产新的细胞因子或生长因子模拟物药物具有重要的指导意义和实用价信。

实施例：

为了和迄今已有报道中生物活性最好的，通过β-丙氨酸-(α-氨基)-赖氨酸-(ε-氨基)-连接肽将二个模拟肽单体的C端相连而成的TPO模拟肽二聚体(Cwirla,S.E.等Science276,1696-1699,1997)作一对比，本实例中合成、使用了TPO模拟肽四聚体。

1．在多肽合成仪上按常规方法合成两个连续的TPO模拟肽，两个连续的TPO模拟肽之间以含有一个半胱氨酸的短肽相连接。合成的线性双体模拟肽经氧化，分离、纯化获得四聚体形式的TPO模拟肽。该四聚体形式的TPO模拟肽由两个线性双体模拟肽分子凭籍一个二硫键相连而成。

2．纯化的TPO模拟肽四聚体经小鼠皮下注射给药。剂量为1ng/10g小鼠体重或0.1μg/每公斤小鼠体重时，给药三次后，小鼠血小板数即增加约60％。

从本实例中可以看到：本发明与现有技术相比较有明显的如下优点：

1．现有方法用β-丙氨酸-(α-氨基)-赖氨酸-(ε-氨基)-两肽作为连接肽合成模拟肽双体分子时，必须合成二条肽链：一条为模拟肽单体，另一条为模拟肽单体-β-丙氨酸-(α-氨基)-赖氨酸分子，这无疑增加了合成及纯化的工作量和成本。同时β-丙氨酸-(α-氨基)-赖氨酸-(ε-氨基)连接肽的使用也大大增加了多肽合成的难度和成本。而上述模拟肽四聚体结构形式的合成方法常规、简单，不需要使用非正常氨基酸或非常规的连接方法，生产方法和工艺简单、常用，成本低廉。在合成方法及成本上，都明显优于通过β-丙氨酸-(α-氨基)-赖氨酸-(ε-氨基)-连接肽将二个模拟肽单体的C端相连，形成模拟肽双体的方法。

2．该类新的模拟物结构形式能非常明显地提高现有的细胞因子或生长因子模拟物的生物活性。以TPO模拟肽四聚体为例：剂量为0.1μg/每公斤小鼠体重时，给药三次后，小鼠血小板数即增加约60％；而报道中的通过β-丙氨酸-(α-氨基)-赖氨酸-(ε-氨基)-连接肽将二个TPO模拟肽单体的C端相连而成的TPO模拟肽二聚体，剂量为250μg/每公斤小鼠体重时，给药五次后，小鼠血小板数增加80％。这种新的细胞因子或生长因子模拟物四聚体结构形式目前在国内外都未见报道。该类新的模拟物结构形式能非常明显地提高现有的细胞因子或生长因子模拟物的生物活性，使之达到可能在临床实际应用的水平。