[发明专利]基因工程制备菠菜叶绿体三糖磷酸酯异构化酶的方法

说明书

本发明涉及分子生物工程，具体地说涉及采用计算机辅助设计基因表达的调控区域、基因克隆、基因表达等基因工程，建立了用大肠杆菌制备高光效植物-菠菜中所有的催化效率很高的蛋白质-菠菜叶绿体三糖磷酸酯异构化酶TPI。

三糖磷酸酯异构化酶TPI是生物体中广泛存在的一种酶，它如图1中所示的催化3-磷酸甘油醛G-3-P与磷酸二羟基丙酮DHAP之间的转化。TPI在生物的新陈代谢中具有重要作用，几乎所有包括三糖磷酸酯的代谢途径都包含着这一转化。如糖酵(Glycolysis)，糖异生(Gluconeogenesis)，戊糖磷酸途径(Pentosephosphate pathway)及脂肪酸的生物合成等，同时，这一过程还是光合作用中固定CO₂的Calvin循环所不可缺少的。高等植物中TPI以两种同功酶的形式存在。存在于细胞质的TPI，即cTPI主要在糖酵解、糖异生中发挥作用，而存在于叶绿体的TPI，即cpTPI主要参与Calvin循环。

1994年文献Henze K.，Schnarrenberger C.，Kellermann J.，&Martin W.1994 Plant Mol.Biol.26：1961-1973中报道了菠菜叶绿体TPI的编码基因序列如图2所示。从已知的该蛋白质一级结构来看，各种来源的TPI是相当保守的，它们的三级结构和作用方式也是十分相近的。其亚基肽链具有典型的(α/β)₈构建方式，它的内层是八股平行的β折叠形成内核圆桶，外层与之相连的八股α螺旋紧紧缠绕形成同心桶状结构，几个大的Loop环、随机卷曲螺旋和β转角连接α螺旋和β折叠。构成圆桶的主要是疏水性氨基酸，疏水边链位于圆桶内侧形成酶的疏水内核，极性氨基酸位于外侧暴露于溶剂之中，活性位点位于桶内侧，呈袋状。当底物与袋状的活性位点结合后，相邻的一段肽环便将底物掩盖起来，以避免水的攻击，保证只进行异构化反应而不发生水解反应；这时另一个亚基上的有关残基也帮助将水从活性区域排除出去，以保证底物和活性位点形成氢键。TPI所具有的这种(α/β)₈结构在自然界是广泛存的。至今已发现包括Rubisco大亚基、醛缩酶等17种不同功能的酶都具有这种(α/β)₈的基本结构，尽管功能上完全不相关，但活性位点都存在于C端附近，通常位于一条β折叠和α螺旋相连的环上。

TPI的催化效率非常高。其催化异构化的反应速率比一个简单的pKa约为7的碱快10¹⁰左右。催化反应的限速步骤是底物与产物出入活性区域的扩散速度。因此，从某种意义上来说TPI已是一个进化得趋近于完美的酶，已经没有什么选择压力来进一步促使其提高催化效率了。