[发明专利]动物角蛋白转基因棉纤维及其基因工程方法

说明书

本发明涉及棉纤维改良基因工程，尤其是关于一种动物角蛋白转基因棉纤维及其基因工程方法。

棉纤维作为一种天然纤维，一直是纺织业和其相关产业的主要原材料。棉纤维由棉花种皮的表皮细胞分化产生。成熟棉纤维中纤维素含量达89％以上，同时含有一部分蛋白。棉纤维的品质，主要决定于纤维强度、长度、伸长度等性状。这些性状主要受基因型控制，环境因子和栽培对其影响低于20％。随着分子生物学研究的深入和植物转基因技术的逐渐成熟，用基因工程方法改良棉纤维品质，将成为培育优质棉的重要手段。目前，美国、澳大利亚等国都投入大量资金进行棉纤维的分子生物学研究。美国Agrocetus公司的科学家M.E.John博士等克隆了数个棉纤维特异表达的基因(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1992，89：5769-5773；John ME，Plant Mol Biol，1996，30：297-306；John ME，Critical Reviewsin Biotechnology，1997，17(3)：185-203)，并利用棉纤维特异表达启动子将外源合成PHB的基因转入棉花，使棉花纤维中产生脂肪聚酯复合物-PHB(多羟基丁酸酯)(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1996，93：12768-12773)。

毛发由角蛋白组成，角蛋白来自多基因家族，根据其氨基酸组成可分为两类，其中一类为角蛋白相关蛋白(KAP)，富含甘氨酸和酪氨酸。国外已从羊和兔中分离到了KAP基因(Fratini A等，The Journal ofBiological Chemistry，1993，268(6)：4511-4518)，在哺乳动物中该基因保持高度同源性。

将兔毛或羊毛的角蛋白基因转入棉花，在棉纤维中特异表达，以改进棉纤维的纤维韧性及保暖性等。这是一种新的思路和技术，具有重大的实用意义。

本发明的目的是提供一种动物角蛋白转基因棉纤维及其基因工程方法，即应用基因工程途径将兔或羊的角蛋白基因转入棉花，使棉纤维中产生兔毛或羊毛的角蛋白成分，改良棉纤维的韧性、保暖性等。

从亚洲棉基因组文库中分离到棉纤维特异表达的启动子；克隆出兔的角蛋白基因，并在原核细胞中表达，制备了角蛋白抗体；接着构建由棉纤维特异启动子驱动角蛋白基因的转基因二元载体，转化棉花后，对转基因棉花进行了组织化学染色、PCR、Southern blot等分子验证。转基因棉花纤维现正处于生长期，待纤维成熟后进一步应用Western blot验证棉纤维中角蛋白的表达；最后对转基因棉花纤维进行显微结构、强度、长度、保暖性等品质特征分析。本发明技术方案详述于后。

本发明提供一种动物角蛋白转基因棉纤维及其基因工程方法，利用棉花转基因技术，在棉纤维中特异表达动物毛(例如羊毛或兔毛)的角蛋白基因，能生产出全新的基因工程棉花，使棉纤维产生兔毛或羊毛的角蛋白成分，保暖性提高，手感等更好。

本发明动物(下面以兔子为例)角蛋白转基因棉纤维及其转基因工程方法及鉴定包括：

1、棉纤维特异表达的GAE6基因的克隆

以亚洲棉DNA为模板进行PCR扩增。所用引物为参阅文献(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1992，89：5769-5773)设计的，分别为E61(5’GCAACCATAGCCATGGCT 3’)和E62(5’GCTTAGTGGACTCGTAGG 3’)。

PCR产物纯化后，采用TA克隆方法装入pGEM-T载体中，转化XL1-Blue(本实验室保存菌种)，然后对插入片段进行PCR鉴定和酶切鉴定。DNA序列由中国科学院上海植物生理研究所分子遗传构建重点实验室技术组用Applied biosystem373型全自动荧光序列分析仪测定。序列用PCGENE软件系统分析。

以PCR-96孔板方法筛选亚洲棉基因组文库，正向引物为E60：5’CCATGGCTTCCTCACCAA 3’，反向引物为E63：5’GGCATTCTTGTTGTAGTAG 3’。经7轮筛选，将阳性孔噬菌体稀释后铺板，挑取单个噬菌斑到SM溶液中，再以PCR鉴定阳性噬菌斑，依照Stratagene的实验指南释放质粒，得到一个阳性克隆，命名为GAE6-3A，经多种酶切鉴定其插入片段长8.0千碱基对(见图1)。

DNA序列由宝生物工程公司Applied biosystem373型全自动荧光序列分析仪测定，所得的GAE6-3A克隆上游启动子长1457个碱基对，其序列见图2。