[发明专利]一种从茶叶提取活化的凝血因子十抑制组分（ATI）方法

说明书

本方法是关于提取活化的凝血因子十抑制组分的问题，属于生物技术领域。

随着科技的发展，天然活化的凝血因子十(FXa)抑制剂成为抗凝血药物的新研究对象。

曾有文献^[1，2]报道，从墨西哥水蛭的唾液中提取出一种物质Antistasin具有抑制FXa的作用，但该物质在水蛭的唾液中含量较低，同时提取过程繁琐，花费较高。又由于其组分中半胱氨酸残基含量很高，克隆表达的成本很高，使其在应用时受到很大限制。所以我们需要一种快速、简便、经济的提纯制备FXa抑制组分的方法。

茶叶作为一种饮料被中国人民很早就饮用。一般认为茶叶的药理作用主要有兴奋神经中枢作用扩张血管，利尿和解毒等作用^[3]。我们发现茶叶中含有FXa抑制组分。

本发明是一种从安徽绿茶中纯化分离活化的凝血因子十抑制组分的方法。其原料容易获得且价格相对较低，通过无水乙醇/氯仿/水三步试剂萃取转化，即可得到有明显选择性的FXa抑制组分。分离纯化的步骤简便，检测明确。从茶叶中提取的活化凝血因子抑制组分是一种选择性很高的抑制剂。图1是ATI对活化的凝血因子十的活性抑制曲线，图2是ATI(萃取样)对凝血酶活性的抑制曲线，图3是Ca²⁺过量时ATI对活化的凝血因子十的活性抑制曲线。对它进行抑制水平的检测可知，有很好的抑制活化凝血因子十活性的效果，即使在Ca²⁺大大过量的情况下亦是如此。它的最大特点是只对FXa具有很强的抑制作用，而对凝血酶的抑制作用则比较低。在血液中存在的活化的凝血因子十抑制剂，如antithrombin-III，却不表现这种专一性。FXa处于内、外源凝血通路的交汇点上，而不与纤溶系统有交叉，所以它有很强的独特性。正由于它不易被其它酶消耗，也有可能是一种很好的药物先导组分。

目前国内外尚未发现从茶叶中提取FXa抑制组分的报道，经实验证明组分中未含有蛋白，说明它是非蛋白类化合物，这在国际上也是首次发现。

本发明的目的就是要通过一个简单的分离步骤得到高活性的活化凝血因子十抑制组分。由于它的专一性、高效性和经济等特点，很有可能会成为新药开发中的一个有兴趣的突破点。本发明的实行方案：

将安徽市售黄花云尖绿茶破碎，①用无水乙醇每百克茶叶四百毫升浸泡。浸泡在室温下进行，4小时之后，充分搅拌30分钟，过滤。②然后每百克茶叶用一百毫升无水乙醇再次萃取，1小时之后，搅拌15分钟过滤。第②步骤进行两遍，得到无水乙醇茶叶萃取液。

将无水乙醇茶叶萃取液在50℃条件下减压蒸馏浓缩至一百毫升左右，加入氯仿三百毫升，充分摇匀，并放置在五百毫升分液漏斗中。将一百毫升重蒸水加入到氯仿/无水乙醇茶叶浓缩萃取溶液中，充分摇动至溶液呈现完全乳化状态，静置分层，可将氯仿层从分液漏斗的下部排出，留下呈淡黄色的水溶液层。

将水溶液组分冷冻干燥得到约2.2克固形物，密封保存在-20℃下。冷冻干燥后的样品进行抑制水平的检测，见附图1、附图2和附图3。从附图1、2、3可以看出，冷冻干燥后的样品有极好的抑制活化的凝血因子十的水平，即使在Ca²⁺大大过量的情况下，亦是如此。而样品对凝血酶活性的抑制则远不如对活化的凝血因子十。

参考文献：[1]Tuszynski P.G.Gasic，B.T.And Gasic，J.G.J.Biol.Chem.，262(20)，   9718(1987)[2]Kaiser B.Seminars in Thrombosis and Hemostasis，17(2)，130(1991)[3]江苏新医学院编，中药大辞典，上海：上海科技出版社出版(1977)，p1601