[发明专利]高比活性重组人干扰素αm及其制作方法

说明书

本发明涉及一种重组人干扰素αm的制作方法，特别涉及一种高比活性重组人干扰素αm的制作方法。

在现有的技术中，已知基因工程人干扰素α1是我国第一批被批准投产的高技术生物技术新药。目前，它是治疗乙、丙型肝炎和恶性肿瘤的重要药物，但其临床疗效也有待进一步提高。此外，大剂量长期使用干扰素的毒副反应也是一个严重问题。干扰素的作用机制是通过与受体结合引发复杂的信号传导而发挥抗病毒和抗肿瘤作用，因此高受体亲合性蛋白质突变体具有提高的生物学活性。

IFNα1c是从我国正常胎肝DNA库中克隆的一种人干扰素α1新变异株，是我国人群的优势亚型。采用定点突变技术构建成的IFNα1c/86D，其比活性与IFNα1c相当，此外将IFNα1c的86C改变为86D后，减少了IFNα1c二聚体的形成，提高了IFNα1c的热稳定性。

本发明的目的在于提供一种高比活性重组人干扰素αm，其比活性高达1.1×10⁸IU/mg。本发明的另一个目的是提供此高比活性重组人干扰素αm的制作方法。

本发明的实施方案如下：

本发明高比活性重组人干扰素αm(pBV220/IFNαm/Jm103，菌种号0390)的组成：

1高效原核表达载体pBV220，用于温控表达外源基因。

2人干扰素αm的DNA作为待表达外源基因。

3表达外源基因的宿主菌为JM103。

本发明高比活性重组人干扰素αm的制作方法分为下列五个步骤：

1噬菌体6肽库的构建、筛选及克隆的鉴定。

2合成肽的免疫反应性和对α1干扰素诱导的抗病毒、抗增殖活性的影响。

3合成肽与α1干扰素受体结合域AB环序列的同源性比较。

4干扰素突变体IFNαm的构建。

5干扰素突变体IFNαm的表达，纯化。

本发明高比活性重组人干扰素αm的优点是：

高比活性重组人干扰素αm的比活性高达1.1×10⁸IU/mg，比国内外制订的α1型干扰素比活性标准高10倍。高比活性重组人干扰素αm用于长期治疗乙、丙型肝炎和恶性肿瘤毒副反应较小。

本发明高比活性重组人干扰素αm的制作方法优选例如下：

1.1噬菌体6肽库的构建按以下序列合成编码6肽的DNA及PCR引物。编码6肽的DNA片段为5′-CTATTCTCACTCGGCCGAGGGGGCT(NNK)6GGGGCCGCTGGGGCCGAAACTGTTGAA-3′其中N代表A,C,G,T四种碱基，K代表G,T两种碱基，共合成72mer。用于扩增编码6肽的DNA的5′端PCR引物为CTATTCTCACTCGGCCGACG,3′端引物为GACCCCGGCTTTGACAACTT。以上合成片段纯化后，用于PCR扩增反应，纯化的扩增产物再经BglⅠ酶切与SfilⅠ酶切的载体FUSE5连接。电转化MC1061宿主菌，获得噬菌体6肽库。

1.2噬菌体6肽库的竞争性筛选：在96孔酶标板上包被干扰素中和抗体4C1，以IFNα1b作为竞争剂，混合噬菌体文库，经充分洗脱后，在96孔板中感染对数中期K91，部分用于转导单位计算，其余涂四环素平板。用聚乙二醇沉淀回收第一轮筛选后的噬菌体。三轮筛选后，重组噬菌体的回收率从10^-7提高到10^-2。

1.3噬菌体阳性克隆的鉴定：用ELISA检测单克隆扩增的噬菌体与4C1结合。包被4C1抗体，以HRP标记的抗M13多抗作为二抗，邻苯二胺(OPD)作为显色底物，并在OD492nm下比色，选择阳性克隆PH1。点杂交和West-blotting进一步证明重组噬菌体PH1与IFNα的中和抗体4C1有作用。DNA序列测定并推导出插入6肽的序列为WLDPRH。

2.1合成肽的免疫反应性：用ABI公司431A型多肽合成仪合成WLDPRH短肽，经HPLC反相柱层析纯化定量，用于随后的竞争性ELISA。包被IFNα1b，分别用WLDPRH和阴性对照肽竞争4C1与IFNα1b的结合。结果表明合成肽WLDPRH可特异抑制抗体与抗原(IFNα1b)的结合。

2.2合成肽对亚浓度人干扰素α1b抗病毒活性的影响：将WISH细胞接种到96孔板，每孔加入梯度稀释亚保护浓度的IFNα1b(含和不含WLDPRH)，处理24小时，加入10⁴Pfu VSV培养24小时，细胞用95％乙醇固定，结晶紫染色，用酶标仪测定570nm吸收值抗病毒结果活性显示合成肽能将IFNα1b的抗病毒百分保护率从40％提高到86％。