[发明专利]一种紫云英单胞锈菌(CGMCC0365)的制造方法

说明书

本发明涉及一种紫云英单胞锈菌(Uromyces punctatus)(保藏号CGMCC0365)，特别是感染于黄花棘豆上的单胞锈菌的制造方法。

紫云英单胞锈菌只感染于黄花棘豆，具有专植性。黄花棘豆属豆科、棘豆属植物，因含有大量生物碱，草场上牲畜采食后中毒死亡，对畜牧业生产造成严重影响。多年来，人们为了避免黄花棘豆对牲畜造成的危害，采取了许多无机、有机方法灭治毒草，但效果均不理想。但在自然界黄花棘豆一但感染紫云英单胞锈菌，次年必然死亡，而且具有专植性，即该菌只感染于黄花棘豆。如果能人工培养出紫云英单胞锈菌，用于灭除黄花棘豆，则将非常有利于草场建设。然而，到目前为止，无人能对紫云英单胞锈菌进行人工培养。

本发明的目的是要解决上述问题，提供一种人工培养紫云英单胞锈菌的方法，为进而用该菌灭除黄花棘豆打下技术前提。

本发明的技术方案是：该紫云英单胞锈菌的制造方法，其特点在于培养基配方(重量百分比)为：白碗豆粉5％-10％，琼脂1％-4％，蒸馏水70％-90％，葡萄糖粉剂2％-15％，硫酸亚铁0.5％-5％；其工艺方法如下：首先，将带菌叶片(黄花棘豆)剪成小片，在氯化钠溶液中浸泡10小时以上；其次，配制培养液，将白碗豆粉加入蒸馏水中，搅匀，浸泡10-28小时，过滤，得滤液，将琼脂加入蒸馏水中加热(100℃)20-60分钟；将加热琼脂液和白碗豆粉滤液合并，再加入葡萄糖粉剂和硫酸亚铁，搅匀，再用氢氧化钠溶液调溶液PH值至8-8.5；最后，先将配好的培养液加热(100℃)灭菌，然后将上述氯化钠溶液中浸泡的野生单胞菌接入培养液中，移至恒温箱中，温度为20℃-28℃，培养10-15天。

本发明的特点是培养基配方(重量百分比)为：棘豆粉0.5％-5％，白碗豆粉1％-10％，蒸馏水70％-90％，葡萄糖粉剂0.5％-15％，硫酸亚铁0.5％-2％；其工艺方法与上述相同。

本发明的优点及效果是：实现了紫云英单胞锈菌的人工培养，为进一步利用该锈菌特别是为生物防治棘豆毒草创造了前提。

实施例1：

a、培养基配方(重量百分比)：白碗豆粉8％，琼脂2％，蒸馏水85％，葡萄糖粉剂4.5％，硫酸亚铁0.5％。

b、培养步骤与方法：(1)将从草场上采得的带菌棘豆叶片剪成小片，分别分数片装入25只高温灭菌具塞试管中，每只试管中均加入氯化钠水溶液(浓度1％)4毫升，浸泡数小时(带菌棘豆鲜叶浸泡24小时，带菌棘豆枯叶浸泡48小时)。

(2)将白碗豆粉250克放入烧杯中，加入无菌蒸馏水1600毫升，搅匀浸泡24小时。

(3)称琼指20克，放入烧杯中加入蒸馏水1000毫升，加热(100℃)30分钟。

(4)将浸泡的白碗豆粉，用折叠两层布进行漏斗过滤，滤液约为750毫升。

(5)将加热琼脂液和豆粉汁均倒入铝锅中，再加入320毫升的蒸馏水，再加入15克葡萄糖粉剂，加入5克硫酸亚铁，搅匀，用PH试纸测试为7-7.5，再用氢氧化钠(浓度10％)滴定，将PH值调至8-8.5。

(6)将配好的培养液加热(100℃)15分钟，再分别装入经高温灭菌的500毫升的三角瓶内，三角瓶具塞包装。

(7)将培养液三角瓶装入高压锅内，高温高压灭菌30分钟。

(8)在无菌室内，分别将试管内的野生单胞锈菌用吸管接入三角瓶培养液中，然后移至恒温箱中，温度26℃。

(9)在恒温箱培养10-15天，锈菌胞子形成。

将生成的锈菌胞子用10％的碗豆粉溶液稀释成10000毫升，同时加入抗氧化剂硫酸亚铁(浓度2％，5毫升)即可。

实施例2，在22℃时，培养生产紫云英单胞锈菌胞子。培养基配方(重量百分比)：白碗豆粉6％，琼脂2％，蒸馏水82％，葡萄糖粉剂6％，硫酸亚铁0.5％，棘豆粉3.5％。操作方法中先将白碗豆粉与棘豆粉混合，其余操作方法与实施例1相同。

实施例3，在28℃时，培养生产紫云英单胞锈菌胞子。培养基配方(重量百分比)：白碗豆粉6.5％，蒸馏水85％，葡萄糖粉剂2.5％，硫酸亚铁1％，棘豆粉5％。操作方法中先将白碗豆粉与棘豆粉混合，本例中不加琼脂，其余操作方法与实施例1相同。