[发明专利]葡萄糖氧化酶基因在培育抗病转基因植物中的应用

说明书

本发明涉及编码葡萄糖氧化酶(GO)基因的DNA序列及其在培育抗病转基因植物中的应用，包括含有GO DNA序列的植物表达载体，由表达载体转化的植物细胞，以及由转化细胞产生的对病原菌表现高抗性的转基因植物及其后代，包括植物种子、整体植物或植物体的部分或组织器官。

细菌及真菌是危害农作物的主要病原菌。虽然目前对某些病害已找到有效的防治方法，但对大多数严重危害农作物的病害尚无切实有效的防治措施。培育抗病品种是防治植物病害的根本措施。但由于病原菌变异迅速，可供利用的抗原匮乏，常规育种的作用受到了很大限制。随着分子生物学、植物病理学及基因工程技术的迅猛发展，运用基因工程手段提高植物的抗病性为抗病育种开辟了一条崭新途径。

植物在接受到病原物的信号(Elicitor)后，导致受侵染部位组织的快速死亡，称为超敏反应(Hypersensitive response，HR)，使病原物失去营养供给，并将病原物限制在最小范围内。寄主植物启动自身的防卫系统，如合成纤维素、木质素和结构蛋白加固细胞壁，合成植保素和抗菌蛋白及酚类化合物的氧化(Hahlbrock &Scheel，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.40：347-369，1989)、防卫基因的表达(Bowles，Annu.Rev.Biochem.59：873-907，1990；Dixon & Harrison，Adv.Genet.28：165-234，1990)、受侵染细胞的过敏性死亡(Keen，Plant Mol.Biol.19：109-122，1992)以及最终诱导系统获得性抗性(Chen et al.，Science 162：1883-1886，1993)。所有这些反应都与植物-病原互作中早期活性氧类(active oxygen species，AOS)的快速合成有关。在氧化激增(Oxidative burst)过程中产生的AOS，如超氧离子(O₂^-)、羟自由基(OH^*)、过氧化氢(H₂O₂)，不仅具有直接杀伤病原菌的作用，而且对激发植物的防卫体系具有重要作用。

，由Muller(1928)首次报道。后来Kim等(Can.J.Microbiol.36：199-205，1989)发现用于防治土传病害的生防菌Talaromycesflavus的主要抗菌机制是通过GO产生H₂O₂。现已从Talaromycesflavus、Penicillium notatum、P.amagasakiense和黑曲霉(Aspergillus niger)中纯化出了GO(Swobada & Massey，J.Biol.Chem.240：2209-2215，1965)。其中，A.niger是GO活性较强的一基酸，22个前导肽，8个糖基化位点，16％的碳水化合物，包括种真菌。黑曲霉GO为一个二聚体，每个亚基70kd，含583个氨甘露糖、半乳糖、氨基葡萄糖，及1分子的辅酶FAD。FAD的结合改变了GO的构型，使焦磷酸区不再处于酶的表面。GO除了以葡萄糖作为底物外，还催化2-脱氧-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖的氧化，但对后三者的活性较低。

由于碳水化合物的作用，赋予GO一定的特性，如100℃不沉淀、0.75％SDS溶液中稳定、5％三氯乙酸缓慢沉淀、水溶性好、高盐环境下沉淀等。

GO在食品保鲜方面有着广泛的应用，牛奶中加入0.1U/ml的GO及0.3mg/ml的葡萄糖可抑制牛奶中荧光假单孢菌(Pseudomonasfluorescens)的繁殖。目前在斯里兰卡、巴基斯坦、肯尼亚等发展中国家有大量应用。另外，还有将GO加入牙膏以防止蛀牙的报道。