[发明专利]修饰的脱乙酰氧基头孢菌素C合酶DAOCS及X射线结构

权利要求书

1．具有本文结构A或结构B的X射线坐标定义的结构的脱乙酰氧基头孢菌素C合酶(DAOCS)。

2．与金属，例如铁或铅形成复合体形式的DAOCS，并可选可不选地在在底物和/或底物类似物或抑制剂的存在下，具有由本文X射线坐标定义的结构。

3．权利要求2的DAOCS，其中底物为青霉素N，青霉素G，2-酮戊二酸或双氧，且抑制剂选自N-草酰氨基酸，吡啶羧酸类和一氧化二氮。

4．DAOCS的三维结构在DAOCS或其它相关2-酮戊二酸依赖性酶的修饰中的应用。

5．权利要求4所述的应用，其中相关的2-酮戊二酸依赖性酶是DACS，DAOC/DACS或参与将7α-甲氧基引入头孢霉素C的加氧酶。

6．权利要求5应用，用于对DAOCS，DACS或DAOC/DACS进行修饰，以使它们较野生型酶更有效地接受非天然底物。

7．权利要求5应用，用于对DAOCS，DACS，DAOC/DACS进行修饰，以使它们将天然底物转变为药物或药物制备中有用的中间体。

8．如权利要求6的应用，其中非天然底物为青霉素，包括青霉素G，青霉素V，6-氨基青霉烷酸，阿莫西林，或具苯基甘氨酸或对羟苯基甘氨酸侧链的青霉素类。

9．权利要求6的应用，其中非天然底物是头孢菌素。

10．权利要求6的应用，其中非天然底物是一种氨基酸，包括蛋白原氨基酸，或一种肽。

11．权利要求6-8任一项所述的应用，其中青霉素G，青霉素V，其它非天然底物或青霉素N被转换为头孢菌素或外亚甲基头孢菌素。

12．一种与DAOCS具有如本文所定义的显著序列相似性的酶，其中青霉素N或DAOC的侧链结合位点经修饰而且至少一个下列位点的至少一个氨基酸残基转变为另外一个氨基酸残基或被缺失：

Thr72，Arg74，Arg75，Glu156，Leu158，Arg160，Arg162，Leu186，Ser187，Phe225，Phe264，Arg266，Asp301，Tyr302，Val303，Asn304；和/或至少一个额外的氨基酸残基插入到区域300-311；前提是与以上氨基酸相互作用的其它残基酸可能也发生改变以配合上面之一改变。

13．一种与DAOCS具有如本文定义的显著序列相似性的酶，其中青霉素N或DAOC的青霉素/头孢霉素结合位点经过修饰，且至少一个以下的氨基酸残基被改变或被缺失：Ile88，Arg160，Arg162，Phe164，Met180，Thr190，Ile192，Phe225，Pro241，Val245，Val262，Phe264，Ile305，Arg306，Arg307，和/或至少一个额外氨基酸残基插入在区域300-311；前提是与以上氨基酸相互作用的其它残其它残基也发生改变以配合上面之一的改变。

14．权利要求12或权利要求13的酶，它是DAOCS或DACS或DAOC/DACS的突变体。

15．权利要求12-14中任一项所述的酶，其中青霉素N或DAOC的青霉素/头孢菌素的侧链以及结合位点经过修饰且权利要求12和13中所限定残基的至少一种发生改变或缺失。

16．权利要求12-15任一项所述的酶，其中引入两个或更多互补突变以产生或缺失结合相互作用，包括氢键，静电，或疏水相互作用。

17．编码权利要求12-16任一项的酶的基因。

18．在发酵条件下能够表达权利要求17的基因的微生物。

19．权利要求18的微生物在青霉素或头孢菌素(包括头孢烯(cepham))家族的β-内酰胺类的生产中的应用。

20．权利要求19所述的应用，其中微生物含有青霉素和头孢菌素生物合成途径中其它经修饰的酶，包括异青酶素N合酶，酰胺水解酶/乙酰转移酶，或L-δ-(氨基己二酰基)-L-半胱氨酸-D-缬氨酸(ACV)合酶。