[发明专利]在转基因苜蓿植株中的蛋白生产

说明书

本发明涉及在苜蓿植株中生产转基因蛋白。更具体地讲，本发明涉及转基因苜蓿植株中生产多聚体蛋白，以用于诸如诊断测定的多种应用。

发明背景

参考资料的完整出处在实施例部分的结尾列出。

用于多种药物相关应用的蛋白的使用要符合政府确立的严格管理要求。例如，在美国，生物制品评价和研究中心(CBER)公布了一套文件，概述了关于转基因生产的蛋白的生产和监测的要求(参见fttp：∥www．fda．gov／cberftp／html)，在加拿大，有一套相似的与生物制品生产的应用相关的管理条例。CBER文件指出，应该由可靠的持续的资源生产生物制品，以确保获得一致的制品(ftp：∥ftp．fda．gov／cber／ptc／ptc_mab．txt)。这是因为：在批准所述制品使用之前，必须对所述制品进行多方面测试和验证，并且所述制品必须可以以同样的形式得到以用于未来的销售。有几个建立成熟的表达系统用以生产生物制品，包括：用于细胞培养物的主细胞库、转基因植物的种子库、用于转基因表达系统的病毒种子原种和用于转基因动物的建立者品系。为使用瞬时表达系统必须产生主载体种子原种，并且定期测试所述表达构成物的稳定性。如果要由细胞系生产诸如单克隆抗体的蛋白，则主细胞库和工作细胞库均需要关于亲代细胞系的特征鉴定、细胞生产方案、纯化和质量控制的文件。尤其是如果开始临床试验，对生产或配制的任何改变则需要对主细胞库和工作细胞库以及制品进行广泛的再特征鉴定，因为这些改变可能导致生物活性的显著改变。CBER文件“用于人类用途的单克隆抗体制品的生产和测试中考虑的要点”(1997年2月28日)中陈述：“建议用于临床前研究的材料的生产采用的方法应该与用于或计划用于生产临床试验的材料的方法相同”。而且，如果将进行任何扩大生产，例如用于2期研究，则“可能必须证明制品的可比性…这可能需要或不需要额外的临床研究”(ftp：∥ftp．fda．gov／cber／ptc／ptc_mab．txt)、

已经用植物来生产转基因蛋白，然而，以上讨论的适用于主细胞系的维持的考虑同样适用于植物相当物(参见Miele，1997)。由于种子不可能无限贮存，因此用于转基因植物的种子库需要定期扩增。种子原种的贮存必须减少对所述目的转基因(the transgene of interest)的潜在的遗传损害。可能影响种子库的任何其它因素也必须加以控制，包括昆虫、真菌或细菌对种子的污染。此外，必须检测所述转基因的稳定性以及产物在一批给定种子的代表植株中的表达水平、或在再扩增种子库后产物在各批种子之间的表达水平。也可能需要比较由不同种子库生产的制品的额外的资料。这后一特征鉴定也适用于鉴定在收获种子原种中年与年之间的变异。一般而言，制品的研制需要持续检测转基因产物的生化特性和生物特性(Miele，1997)。当这些标准与用以生产多聚体蛋白植物系统结合时，问题复杂化了，因为为了生产能够生产多聚体蛋白的杂交种子，得自各批同源种子、如上概述需要再扩增和维持的转基因植株需要杂交，以生产最终的杂交种子，这又必须如上所述进行维持。显然，需要稳定的并且导致持续供应蛋白、而不需广泛维持多个种子库的替代的转基因蛋白的资源。

在文献中，充分确立了用植物制备转基因蛋白，并且已经建立了几个成功的转化系统。已经通过烟草植株的有性杂交子代生产多聚体蛋白(Hiatt 1990，Hiatt和Pinney，1992；Ma等1995)，然而，迄今为止，在药学应用方面已经用于转基因蛋白生产的所有植物来源都利用一年生植物。这必需不断地如上所述扩增并且再检验种子库原种。显然，如果利用多年生植物物种来产生转基因蛋白，则可能大大降低总体维持费用和各批之间的变异性。而且，如果收获多年生植物的营养体结构作为转基因蛋白的来源，则更降低了管理上的要求。为了确保转基因蛋白多年生来源的生产，必须考虑涉及上述关于得自稳定、持续来源的制品的可靠性一致性的要求的许多因素。

最重要的血液分组试剂之一是用以检测不凝集型抗体的抗人IgG试剂。已经获得了具有合适抗人IgG特异性的小鼠mAb，并用其逐渐取代传统用于Coombs试剂的兔多克隆抗人IgG(St Laurent等1993)。这些mAb用B细胞杂交瘤的大规模培养物生产。尽管该方法可靠，但该方法很昂贵，因为它需要复杂的设备、昂贵的培养基和受过训练的人员。与mAb其它诊断应用相比，用于血库测试的蛋白的市场是高度竞争性的；因此蛋白的价格相对低，并且mAb生产的成本效率已成为关键的问题。