[发明专利]含有志贺菌毒素和目的治疗肽的嵌合多肽

说明书

本发明涉及用于蛋白或多肽的细胞内转运及某些表位的膜呈递的物质及其应用。

逆向转运可定义为细胞膜分子向内质网(RE)的行进，有时经过高尔基体。在几类羧基末端带有四肽KDEL(或在酵母中为HDEL)的内质网蛋白中证明了这种机制。生化和形态学证据都表明这些蛋白离开内质网、到达高尔基体，在这里进行糖链的修饰，然后再转向内质网。四肽KDEL是一种保留信号，它能捕捉在内质网中与其结合的肽或蛋白，如Lewis M.J.等在《自然》(Nature)，348，(6297)：162：3，1990年11月8日中所述，这种捕捉是通过与基元KEDL的受体蛋白相互作用而发生的。

证明存在细胞内逆向转运的另一些证据来自对某些细菌毒素的研究，它们在通过内质网后进入真核细胞的胞质中(Pelham等，1992，细胞生物学趋势(Trends cell.Biol.)，2：183-185)。经研究的一个具体实例是痢疾志贺氏菌的志贺菌毒素(Shiga toxin)以及大肠杆菌的志贺菌型毒素。这些毒素是两条多肽链的复合物，一条(A片段)是毒性片段并具有脱腺苷酶活性，它通过对28S核糖体RNA的作用抑制蛋白质的合成，另一个亚单位(B片段)使毒素与其靶标偶合(O’Brien等(1992)，Curr.Top.Microbiol.Immunol.180：65-94)。电子显微镜研究证明在A431细胞、Vero细胞、特别是Dandi细胞中可检测到志贺菌毒素(Sandvig等，1992和1994；KHINE，1994)。另外，用一种真菌代谢物(其可造成高尔基体结构的丧失)处理细胞可保护细胞抗志贺菌毒素，这也提示这些毒素在到达内质网之前通过了高尔基体。Kim等(1996)最后证实这种毒素的B片段定位于高尔基体中。

在下列文献中给出了对逆向转运、特别是志贺菌毒素B片段在内质网中转运的认识状态：Sandvig等(1992)，自然，358：510-512，Sandvig等(1994)，细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)126：53-64；Kim等(1996)，细胞生物学杂志134：1387-1399。

现将细胞内转运定义为细胞不同区室间交换的总和。

本申请的作者发现，B片段不但向内质网行进，而且向造血细胞系、特别是树状细胞和巨噬细胞的细胞核中行进。

作者证明，将这些细胞在2微摩尔B片段-gly-KDEL如下文所述保温3小时、然后固定，在这些细胞的核中、甚至在核仁中呈现抗该毒素的特异性抗体(结果未公开)，这清楚地表明存在该片段的细胞内转运。

本发明源自对志贺菌毒素B片段(B片段)细胞内转运的这些观察结果，并利用其行进特性构建含有下列元件的嵌合多肽：

-与该片段或其任何功能等价物连接的目的治疗肽或多肽，或

-带有欲表达序列的多核苷酸序列。B片段和多核苷酸序列的连接通过本领域技术人员已知的任何技术、特别是Allinquant B.等在《细胞生物学杂志(Journal of Cell Biology)，1288(5)：919-27，(1995)中描述的技术进行。

除DNA分子或其他分子与B片段的共价连接外，这种连接可以借助于强的非共价相互作用来实现。例如，B片段的cDNA与链亲和素或亲和素的任何衍生物的cDNA融合，按已公开的方法进行(Johannes等(1987)，生物化学杂志(J.Biol.Chem)，272：19544-19561)。

可将融合产生的蛋白(B-链亲和素)与利用生物素化引物经PCR或用任何其他生物素化物质获得的生物素化DNA反应。形成的复合物存在于靶细胞中并将如细胞内B片段那样被转运。

另一种连接方法求助于B片段的位点特异性生物素化步骤。为此，将B片段的cDNA与编码酶BirA识别位点的cDNA融合(Boer等(1995)，细菌学杂志(J.Bacterial)，177：2572-2575；Saou等(1996)，基因(Gene)，169：59-64)。体外生素化后，通过链亲和素或亲和素的任何其他四价衍生物的作用B片段与生物素化的其他分子连接(如cDNA，见上文)。

功能等价物应理解为通过突变、缺失或添加而衍生自B片段并具有B片段的行进特性的任何序列。