[发明专利]从米曲霉中克隆脯氨酰二肽基肽酶

说明书

本发明涉及来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的新重组脯氨酰二肽基肽酶，编码此酶的基因，表达此酶的重组细胞，以及水解包含蛋白的物质的方法。技术状况

水解蛋白质被广泛应用于食品工业中，可通过酸、碱或酶水解含蛋白物质进行制备。但另一方面，酸或碱水解在水解过程中破坏必须氨基酸，因而降低营养价值，而酶水解极少进行完全，因而被水解蛋白包含大量的肽。

丝状子囊菌米曲霉已知其分泌大量多种淀粉酶，蛋白酶和肽酶，其反应为其有效溶解和水解原料所必要的(见WO 94/25580)。多种方法可用米曲霉生产食物产品，尤其包括使用日本酒曲培养物的方法。

EP 47481(Nestle)描述了生产发酵酱油的方法，其中日本酒曲通过将米曲霉日本酒曲培养物与煮过的黄豆和焙小麦的混合物混合制备，然后日本酒曲在含水悬浮液中45℃-60℃水解3至8小时，其中有在米曲霉日本酒曲悬浮液发酵过程中的酶，酱醪通过加氯化钠至水解的日本酒曲悬浮液而进一步制备，酱醪进一步与酵素(酶)混合，压榨，所获溶液进行巴氏消毒，澄清。

EP 429 760(Nestle)描述了生产香味剂的方法，其中制备富含蛋白质物质的含水悬浮液，蛋白质在pH6.0-11.0时被悬浮液和蛋白酶水解，悬浮液在pH4.6-6.5时热处理，与米曲霉发酵的日本酒曲培养物的酶一起成熟。

同样，EP96201923.8(Nestle)描述了生产肉类香料的过程，此过程中制备包括植物蛋白质源和植物碳水化合物源的混合物，所述混合物含至少45％干物质，混合物用日本酒曲培养物接种，该日本酒曲培养物由米曲霉和其它一或多种传统食物发酵包括的微生物发酵，混合物培养至肉类香味形成为止。

根据蛋白的本性和蛋白水解应用的酶，形成的肽可能有强烈的苦味，为感觉不可接受的，因此需要能导致高程度蛋白水解蛋白水解的方法且水解产物器官感觉良好。

此外，在酶水解的富含蛋白物质中，需高水平的谷氨酰胺酶，用于将谷氨酰胺转换为谷氨酸，谷氨酸为重要的天然的口味增进剂(见WO95/31114)。对米曲霉水解的谷物，例小麦谷蛋白，进行残余肽的生化分析，显示在包含脯氨酸的肽中，可观量的谷氨酰胺保持汇集(Adler-Nessen，食物蛋白的酶水解。Elseviet应用科学出版社LTD，p120，1986)。因此需要蛋白水解方法以释放大量的谷氨酰胺。

在从日本酒曲霉菌所知的不同蛋白水解酶中，两种中性内肽酶(Nakadai等，农业生物化学，37，2695-2708，1973)，一种碱性内肽酶(Nakadai等，农业生物化学，37，2685-2694，1973)，一种天冬氨酸蛋白酶(Tssujita等，生物化学生物物理现状(Biochem.Biopys.Acta)，445，194-204，1976)，几种氨肽酶(Ozawa等，农业生物化学，37，1285-1293，1973)，几种羧肽酶(Nakadai等，农业生物化学，37：1237-1251，1970)被分辨并纯化。

近来在米曲霉中检测到脯氨酰二肽基肽酶的活性，此酶提供针对X-Pro起始的蛋白和肽特异性高水平水解，从而释放X-Pro型的二肽，其中X为任意氨基酸(Tachi等，植物化学，31，3707-3709，1992)。发明概述

本发明从米曲霉中获得新重组脯氨酰二肽基肽酶(DPP IV)或其功能衍生物，该肽酶包括SEQ ID NO：2的从氨基酸1到氨基酸755的氨基酸序列。

第二，本发明还提供编码本发明的酶的DNA分子。

第三，本发明通过重组技术提供表达本发明的酶的细胞。

第四，本发明提供天然具脯氨酰二肽基肽酶活性的曲霉，与天然指导编码脯氨酰二肽基肽酶活性的基因表达的曲霉天然启动子的多拷贝结合。

第五，本发明提供天然具脯氨酰二肽基肽酶活性的曲霉，其活性由基因工程操作从而使dpp IV基因失活。

第六，本发明提供生产本发明的酶的方法，包括在细胞表达此酶的条件下，在适当的生长培养基中培养本发明的细胞，并任选以浓缩物的形式选择性分离酶。

第七，本发明提供运用本发明的酶或细胞水解含蛋白的物质的方法。

另一方面，本发明提供运用具脯氨酰二肽基肽酶活性的酶和/或细胞，与至少一种提供脯氨肽酶的酶共用，水解含蛋白的物质。

最后一方面，本发明提供一种食物产品，该产品包括至少用一种微生物发酵获得的蛋白水解产物，该微生物在含1％(w/v)小麦谷蛋白的基本培养基中生长时，具有超过50mU/ml的脯氨酰二肽基肽酶的活性。发明详述