[发明专利]嵌合黄病毒疫苗

说明书

                   发明背景

本发明涉及可用作抗黄病毒属所致疾病之疫苗的传染性、减毒病毒。

黄病毒科的几个成员对全球公共健康造成现实或潜在的威胁。例如，日本脑炎(Japanese encephalitis)是一种使远东数百万个体遭受风险的重大的公共健康问题。据估计全球范围内原发性登革热的年发病率为1亿例，出血性登革热的发病率超过450,000例，登革热(Dengue)病毒已经显示出是唯一一种最重要的由节肢动物传播的人类疾病。其它黄病毒不断产生性质变化的地方病，具有随气候，携带者群体的改变，和人类活动导致的环境混乱，而进入新地区的潜能。这些黄病毒包括，例如，St.Louis脑炎病毒，它导致美国中东部，东南部，和西部偶发但严重的急性疾病；西尼罗河(West Nile)病毒，它导致热病，偶尔并发急性脑炎，它在非洲大部，中东，前苏联，和欧洲部分地区广泛传播；Murray山谷(Murray Valley)脑炎病毒，它引起澳大利亚地方性神经系统疾病；蜱传(Tick-borne)脑炎病毒，它在前苏联大部和东欧传播，在那里这种病毒的硬蜱传播者很盛行，造成这些地区脑炎极为严重。

丙型肝炎病毒(HCV)是黄病毒属家族的另一个成员，具有与上述黄病毒相似但不相同的染色体构成和复制策略。HCV大都经非肠道接触感染，它与能够发展成为肝硬化和肝细胞癌的慢性肝炎有关，在美国它还是需要常位移植的肝病的起因。

黄病毒科与α病毒属(alphaviruses)(例如，WEE，VEE，EEE，SFV等)不同，目前包含三个属：黄病毒属、瘟病毒属、和丙型肝炎病毒属。黄病毒属的完全加工后的成熟病毒颗粒包含三个结构蛋白：包膜(envelope，E)蛋白，衣壳(capsid，C)蛋白，和膜(membrane，M)蛋白，以及七个非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，和NS5)。在感染细胞中发现的未成熟的黄病毒颗粒包含前-膜(prM)蛋白，它是M蛋白的前体。

病毒颗粒与宿主细胞受体结合后，E蛋白暴露于内体的酸性pH值下，发生不可逆的构型改变，导致病毒颗粒的双层包膜与胞内小泡融合，由此将病毒基因组释放到宿主胞质溶胶中。含有prM的蜱传脑炎(TBE)病毒无融合能力，表明prM的蛋白酶解加工过程对于产生有融合能力和完全传染性的病毒颗粒是必要的(Guirakhoo等，病毒遗传学杂志(J.Gen.Virol.)，72(Pt.2)：333-338，1991)。在病毒复制循环后期，用氯化铵处理，产生含prM的Murray山谷脑炎(MVE)病毒，并显示无融合能力。利用序列特异性肽和单克隆抗体，证明prM可与E蛋白的200-327位氨基酸相互作用。这种相互作用对于保护E蛋白免受由胞外途径的酸性小泡中熟化导致的不可逆的构型改变是必要的(Guirakhoo等，病毒学，191：921-931，1992)。

prM裂解为M蛋白，随即弗林蛋白酶样细胞蛋白酶释放病毒颗粒，(Stadler等，病毒学杂志，71：8475-8481，1997)，这对激活血凝活性、融合活性、和病毒颗粒的感染性是必要的。M蛋白由位于共有序列R-X-R/K-R(X是可变的)之后的它的前体蛋白(prM)分解而成，并与E蛋白一起掺入病毒的脂质包膜。

裂解序列不仅在黄病毒属中为保守序列，而且在其它非相关病毒的蛋白质，例如鼠冠状病毒的PE2、α病毒属的PE2、流感病毒的HA、和逆转录病毒的p160中也为保守序列。病毒感染性的关键在于前体蛋白的裂解，而不是颗粒的形成。据报道，在一例TBE-登革热4型嵌合体中，prM裂解位点的改变导致这种嵌合体的神经毒力降低(Pletnev等，病毒学杂志，67：4956-4963，1993)，这与以前的观察结果，即prM的有效加工对完全感染性是必要的一致(Guirakhoo等，1991，同上，1992，同上；Heinz等，病毒学，198：109-117，1994)。prM蛋白的抗体可以介导保护性免疫，这显然是因为能够中和所释放的含有一些未裂解prM的病毒颗粒。通过感染性克隆的定点诱变缺失了VEE的PE2的蛋白酶解裂解位点(4个氨基酸)(Smith等，ASTMH会议，12月7-11，1997)。缺失突变体高效复制，PE2蛋白掺入颗粒中。这种突变体在非人灵长动物中得以评价，显示100％的血清转化，并保护所有经免疫猴使之免遭致命的攻击。

                    发明概述

本发明以嵌合、活体、感染性的减毒病毒为特征，它们各由以下方面构成：