[发明专利]含有重组血管内皮生长因子B(VEGF－B)DNA的转基因动物及其用途

说明书

发明领域

本发明涉及含有重组DNA的转基因动物和来自该动物的细胞，其中该DNA具有来自血管内皮生长因子B(VEGF-B)基因的修饰的核苷酸序列。该转基因动物和细胞对于血管发生和肿瘤形成的研究和进展，且特别是对于测定物质的VEGF-B样活性有用。

发明背景

正如其名称所暗示的，血管内皮生长因子(VEGF)是一种内皮细胞特异性促细胞分裂原。它具有潜在的血管发生活性，即它促进新血管的生长。生命的生理过程，血管发生涉及许多血液和血管细胞的蛋白质。在血管发生过程中，促细胞分裂因子，如VEGF，起重要作用。然而，这些因子所起作用的生化细节并不总是唾手可得的。

VEGF被鉴定和表征后，许多重要的发现将注意力集中在血管生成因子的活性和新因子的阐述上。早期的发现表明血管发生是正常发育和生理学所必需的。具体地说，诸如胚胎发生，伤口愈合和黄体形成的过程均涉及血管发生和血管生成因子。例如，在伤口愈合期间，VEGF mRNA水平升高，这表明VEGF的表达和愈合过程直接相关。另外，VEGF调节的缺陷可能与伤口愈合的紊乱相关。(Frank，S.，等，生物学化学杂志，2705：12607-12613(1995)。)

与血管生成因子相关的其它重要发现表明，持久的且不受调节的血管发生会恶化和引起许多疾病。例如，关节炎涉及新的毛细血管侵入关节并破坏软骨。在糖尿病中，视网膜中的新毛细血管侵入玻璃体液，引起出血和失明。(Folkman，J.和Shing，Y，生物学化学杂志，267(16)：10931-10934(1992))。血管生成因子在这些和其它疾病中的作用尚未清楚确定。

另一重要发现涉及血管发生和肿瘤进展间的联系。肿瘤生长和癌转移均是血管发生依赖性过程。(Folkman，J.和Shing，Y.，生物学化学杂志，267(16)：10931-10934(1992))。例如，当肿瘤细胞导入动物时，VEGF mRNA的表达方式表明在坏死的肿瘤生长区外周的细胞中以最高水平表达。在这些区域内鉴定了许多血管。在这些区域中VEGF的表达表明低氧血症(缺陷型氧合症状)触发坏死的肿瘤中VEGF的表达和释放。在下文更充分讨论的另一血管内皮细胞促分裂素，VEGF-B也与肿瘤生长，特别是黑素瘤直接相关。(1996年3月1日申请的美国申请系列号08/609,443)。

VEGF是在结构上与血小板衍生生长因子(PDGF)相关的蛋白质家族的一个成员。PDGF是平滑肌细胞，神经胶质细胞和其它一些细胞类型的潜在促细胞分裂原。在一个方面，以存在8个保守的半胱氨酸残基来鉴定PDGF家族的成员。在其有活性的生理学状态下，该蛋白质在8个半胱氨酸残基上以分子间和分子内键经二硫键形成二聚体。在另一方面，该家族成员在其促细胞分裂作用(特别是对内皮细胞和相关的细胞类型的作用)上相关。

血管内皮生长因子B(VEGF-B)，一种非糖基化的高碱性生长因子是一种新鉴定的PDGF家族的成员。由于与VEGF，PDGF-A，PDGF-B，和PlGF(胎盘生长因子)密切的结构相似性，VEGF-B在成年和胚胎组织，特别是在肌肉组织的血管发生中发挥作用。VEGF-B也是一种血管发生促细胞分裂原。VEGF-B在哺乳动物的许多组织中表达，但在心脏，骨骼肌和胰脏中最丰富。VEGF-B的表达情况不同于VEGF，尽管两者均在许多组织中表达。(Olofsson，B.等，美国科学院学报，93：2576-2581(1996))。

与其相关的促细胞分裂蛋白质一样，VEGF-B在体内以二硫键连接的二聚体存在。作为结构相似性的证明，VEGF-B与VEGF形成杂二聚体，这与参与PDGF-类蛋白质分子间和分子内二硫键结合的8个半胱氨酸残基保守一致。而且，VEGF-B和VEGF在许多组织中共同表达表明在天然状态下存在VEGF-B-VEGF杂二聚体。VEGF也与PlGF形成杂二聚体。(DiSalvo，等，生物学化学杂志，270：7717-7723(1995))。在该生长因子家族成员间产生的杂二聚体复合物可提供一系列血管发生或调节分子的基础。

正如所述，VEGF-B在许多组织和细胞类型中表达。例如，本文作为参考文献特别引用1996年3月1日申请的共同未决的美国申请系列号08/649,443，其详细描述的RT-PCR试验证实了在黑素瘤，正常皮肤和肌肉中存在VEGF-B mRNA。另外，Northern印迹显示了在各种小鼠和人组织，包括心脏，大脑和骨骼肌中的mRNA。