[发明专利]组合文库的多样性的产生

说明书

生物技术演变方法，包括组合文库和噬菌体展示技术(PARMLEY&SMITH 1988；SCOTT&SMITH 1990；SMITH 1993)可用于寻找新的诊断配体，生物医学和药物应用的配体(综述；CORTESE 1996；COLLINS 1997)。已经将利用经验程序从不同的基因产物的大群体中选择具有所需的特征例如结合特性的分子的这些方法比作天然演变的过程。演变包括在一段时间内突变的产生，功能的选择和系统的自我复制的能力。特别是，天然系统利用重组将选定的群体中积累的突变重配以使突变的组合呈指数增加并且因此增加了群体中变异体的数目。近来仅仅将这称之为突变基因内导入重组的后一方面应用到生物技术的演变方法，虽然已经将它用于增加起始的噬菌体展示文库的大小(例如WATERHOUSE 1993；TSUUSHITA1996；SODOYER 1994；FISCH 1996)。STEMMER 1994a，1994b和1995告诉我们通过小重叠片段与(1994a，1994b)或不与(STEMMER1995)用于驱动PCR反应的引物寡核苷酸序列的混合物进行PCR扩增可以体外获得DNA分子的群体内的重组。该方法不适用于完全随机化(高度突变的)的序列内的重组，因为该方法依赖于在重组位点的重叠序列的高度同源性。但是STEMMER 1994b和CRAMERI 1996a证实体外重组对于分子演变的有效性，其中CRAMERI 1996b也证实了该方法与噬菌体展示的结合应用，即使该方法限制到低突变密度区域(他们的方法中约0.5-1％的碱基被突变)，因为他们声明现有的诱变方法中重组的优势似乎能增加分子演变的周期的数目(STEMMER1994b)。我们指出这是由于不言而喻的事实，通过在现有的突变体结构中导入碱基变化的诱变制备的许多变异体是附加的，即线性增加的功能，而突变的变异体之间的重组的应用产生了作为起始数目的变异体的指数函数关系的新的变异体。因此经典的噬菌体展示文库对于产生新的变异体有重大的缺点；例如为了包括十肽序列的所有可能的变异体，需要20⁸＝2.56×10¹⁰不同的变异体。

MARKS1992声明在组合的文库中产生较高的特异性时，例如在形成在噬菌体展示文库中显示的免疫球蛋白的再改组的轻链和重链时获得较高特异性和结合常数的抗体时重组的重要性。这些作者没有说明例如通过允许重组的载体如何可以获得所有的轻链和重链在两种链的异源群体中的改组。重链和轻链是一个接一个地选择的，即首先在不变的轻链存在下从异源重链群体中选择最适的重链，然后通过制备新的文库，选择与预选择的最适重链结合的最适轻链。目前使用的包括共有的突变文库，体内诱变，易错PCR以及链改组的花费大量时间的依次的最适化方案概括于COLLINS 1997的图5和6。

噬菌体和噬菌体展示文库的总的背景技术

制备含有极大量(10⁶-10¹⁰)的变异体的基因文库。将变异基因区段融合到丝状噬菌体的外膜蛋白基因(例如M13，fd或fl)，将该融合基因插入到噬菌体或噬菌粒的基因组。噬菌粒定义为含有丝状噬菌体的包装和复制源的质粒。这后一特性允许当它存在于感染了丝状噬菌体的大肠杆菌宿主菌株(超感染)时，噬菌粒基因组包装到噬菌体外膜。经过包装产生的颗粒是噬菌体或噬菌粒，它们在分泌到培养基中的颗粒的表面提供融合蛋白质。这样的经过包装的颗粒能够将其基因组注射到新的宿主细菌，而它们分别被繁殖为噬菌体或噬菌粒。该系统的特异性在于事实：由于包装发生在通常由单个变异体噬菌体/噬菌粒感染的单个的细胞中，繁殖所产生的颗粒含有编码在颗粒的表面提供的特定的变异体的基因。由于所显示的变异体蛋白质的特定的特性，例如结合到固定到表面的特定的靶分子对显示所需特性的克隆的亲和性选择的几个循环，随后进行富集的克隆的扩增导致具有这些特性的小量的不同的克隆的分离。然后通过对变异体基因的过度突变的区段的测序快速地阐明了这些变异体的一级结构。

产生组合的文库的效力