[发明专利]包括相应于地衣芽孢杆菌A210、H405和/或、T412的残基的修饰的突变α－淀粉酶

说明书

发明领域

本发明涉及其中引入了突变，在某些特定状况下提供额外的稳定性的α-淀粉酶。尤其期望突变体将有改变的性能特征，如改变的稳定性和/或改变的活性状态。

发明背景

α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)大部分随机水解淀粉内的内部α-1，4-糖苷键，产生分子量比较小的麦芽糖糊精。α-淀粉酶有相当大的商业价值，通常用于淀粉加工的初始阶段(液化)；酒精生产；去污剂基质中的清洁剂及纺织业中的退浆过程。α-淀粉酶由多种微生物制造，包括芽孢杆菌及曲霉。大部分商业淀粉酶的细菌来源通常是地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌等。近年来，优选的商用酶通常来自地衣芽孢杆菌，因为它们在高温中稳定，并在商业操作条件下性能良好。

通常淀粉至果糖的加工过程有四个步骤：液化颗粒淀粉、糖化液态淀粉为葡萄糖、纯化及异构化为果糖。淀粉液化过程的目的是转变浓缩的淀粉聚合颗粒悬浮液为可溶性、低粘度的短链糊精溶液。这一步骤对于方便地使用标准设备和有效地转变为葡萄糖或其它糖非常重要。为了液化颗粒淀粉，必须将颗粒淀粉的温度增加至摄氏72度以上，使颗粒凝胶化。加热过程立即分裂不能溶解的淀粉颗粒，产生水溶性的淀粉液。溶化的淀粉液然后由α-淀粉酶(EC3.2.1.1)液化。

常用的酶液化过程需要添加氢氧化钙、氢氧化钠或碳酸钠以便调整颗粒淀粉浆的pH至6.0-6.5之间，这是地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的最适pH。添加氢氧化钙的优点是同时提供钙离子，使α-淀粉酶稳定不至失活。添加α-淀粉酶后，悬浮液被泵过蒸汽喷嘴，使其温度立即提升至摄氏80-115度。淀粉立即凝胶化，由于α-淀粉酶的存在，淀粉通过(1-4)糖苷键的随机水解解聚成为易于泵送的液体。

液化过程的第二种方法是在淀粉悬浮液内添加α-淀粉酶，悬浮液保持在摄氏80-100度，使淀粉颗粒部分水解；部分水解的淀粉悬浮液被泵过温度超过约摄氏105度的喷嘴，使剩余的颗粒完全凝胶化。凝胶化淀粉冷却后，可作第二次添加α-淀粉酶以便进一步水解淀粉。

液化过程的第三种方法称为干磨过程。在干磨过程中，整谷粒被研磨后加水。胚芽可选择性地通过漂浮分离或类似技术除去。所得的混合物包括淀粉、纤维、蛋白质及谷粒的其它成分将使用α-淀粉酶进行液化。通常，在使用干磨过程时，酶液化将在较低的温度下进行。淀粉转变为可溶性糊精过程中使用低温液化的效率不如高温液化。

通常，在凝胶化后，淀粉液在添加α-淀粉酶后保持高温直至葡萄糖当量达到10-20，这通常需要1-3小时。葡萄糖当量(DE)是量度总还原糖浓度的工业标准，以D-葡萄糖的干重量为计算基础。非水解的颗粒淀粉的葡萄糖当量几乎是零，而D-葡萄糖的葡萄糖当量为100。

含α-淀粉酶的淀粉液可以保持的最高温度视酶的微生物来源及α-淀粉酶分子的分子结构而定。使用野生型枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌菌株所生产的α-淀粉酶的操作温度通常不超过约摄氏90度，因为在该温度以上将产生过度快速的热失活，而使用野生型地衣芽孢杆菌菌株生产的α-淀粉酶则可以在高达约摄氏110度的温度下操作。已知淀粉和钙离子的存在可稳定α-淀粉酶不至失活。然而，α-淀粉酶是在pH值6以上的环境下使用，以防快速失活。在低温下，来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶可在pH值低于5的环境下对淀粉底物显示出水解活性。不过，当α-淀粉酶在普通喷射温度，例如摄氏102度至109度之间进行淀粉水解时，pH值必须保持在至少5.7以上以防过度快速失活。pH的要求使加工可能性减少，因为pH值6.0以上将产生不良的副产品，如maltulose。因此，事实上，液化过程中的pH通常保持在5.9及6.0之间，以便得到令人满意的水解淀粉产量。

与液化的pH有关的另一个问题是必须将来自湿磨步骤的玉米淀粉悬浮液的pH从约4增加至5.9-6.0。此pH调整需要添加昂贵的酸性中和化学品，及在最后的淀粉产品中进行附加的离子交换精制步骤以便去除化学品。此外，液化后的步骤通常是使用葡糖淀粉酶将液化淀粉糖化为葡萄糖，此步骤需要4-4.5的pH；因此pH必须从5.9-6.0下调至4-4.5，因而需要添加额外的化学品及精制步骤。

液化后，加工的淀粉由葡糖淀粉酶糖化为葡萄糖。目前加工过程的一个问题是由于淀粉不完全液化，例如淀粉酶所做的直链淀粉水解效率低，使糖化混合物内含残留淀粉。残留淀粉不容易被葡糖淀粉酶所水解。这将使产量减少，并干扰糖浆的顺流过滤。

此外，很多α-淀粉酶都需要添加钙离子使其稳定，这进一步增加液化成本。